Summary

Implementazione della resezione minimamente invasiva del tumore cerebrale nei roditori per la raccolta di tessuti ad alta vitalità

Published: May 09, 2022
doi:

Summary

Il presente protocollo descrive una resezione standardizzata dei tumori cerebrali nei roditori attraverso un approccio minimamente invasivo con un sistema integrato di conservazione dei tessuti. Questa tecnica ha implicazioni per rispecchiare accuratamente lo standard di cura nei roditori e in altri modelli animali.

Abstract

Il presente protocollo descrive un paradigma standardizzato per la resezione del tumore cerebrale dei roditori e la conservazione dei tessuti. Nella pratica clinica, la resezione tumorale massimale è il trattamento standard di cura per la maggior parte dei tumori cerebrali. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di tumore cerebrale preclinico attualmente disponibili non includono la resezione o utilizzano modelli di resezione chirurgica che richiedono molto tempo e portano a una significativa morbilità postoperatoria, mortalità o variabilità sperimentale. Inoltre, eseguire la resezione nei roditori può essere scoraggiante per diversi motivi, tra cui la mancanza di strumenti o protocolli chirurgici clinicamente comparabili e l’assenza di una piattaforma consolidata per la raccolta standardizzata dei tessuti. Questo protocollo evidenzia l’uso di un dispositivo di resezione multifunzionale e non ablativo e di un sistema integrato di conservazione dei tessuti adattato dalla versione clinica del dispositivo. Il dispositivo applicato nel presente studio combina l’aspirazione sintonizzabile e una lama cilindrica all’apertura per sondare, tagliare e aspirare con precisione il tessuto. Il dispositivo di resezione minimamente invasivo svolge le sue funzioni attraverso lo stesso foro di bava utilizzato per l’impianto iniziale del tumore. Questo approccio riduce al minimo le alterazioni dell’anatomia regionale durante la biopsia o gli interventi chirurgici di resezione e riduce il rischio di una significativa perdita di sangue. Questi fattori hanno ridotto significativamente il tempo operatorio (<2 min/animale), migliorato la sopravvivenza postoperatoria degli animali, minore variabilità nei gruppi sperimentali e si traducono in un'elevata vitalità dei tessuti e delle cellule resecati per analisi future. Questo processo è facilitato da una velocità della lama di ~ 1.400 cicli / min, che consente la raccolta dei tessuti in un sistema chiuso sterile che può essere riempito con una soluzione fisiologica di scelta. Data l'importanza emergente di studiare e modellare accuratamente l'impatto della chirurgia, la conservazione e la rigorosa analisi comparativa dei campioni di resezione tumorale regionalizzati e delle terapie somministrate all'interno della cavità, questo protocollo unico amplierà le opportunità di esplorare domande senza risposta sulla gestione perioperatoria e sulla scoperta terapeutica per i pazienti con tumore cerebrale.

Introduction

Il glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune e aggressivo negli adulti. Nonostante i recenti progressi nella neurochirurgia, nello sviluppo mirato di farmaci e nella radioterapia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni per i pazienti con GBM è inferiore al 5%, una statistica che non è migliorata significativamente in oltre tredecenni1. Quindi, c’è bisogno di strategie di trattamento più efficaci.

Per sviluppare nuove terapie, sta diventando sempre più evidente che i protocolli sperimentali devono (1) utilizzare modelli preclinici traducibili che ricapitolino accuratamente l’eterogeneità e il microambiente del tumore, (2) rispecchiare il regime terapeutico standard utilizzato nei pazienti con GBM, che attualmente include chirurgia, radioterapia e chemioterapia, e (3) tenere conto della differenza tra nucleo resecato e residuo, tessuti tumorali invasivi 2,3,4,5. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di tumore cerebrale preclinico attualmente disponibili non implementano la resezione chirurgica o utilizzano modelli di resezione chirurgica che richiedono relativamente tempo, portando a una quantità significativa di perdita di sangue o mancanza di standardizzazione. Inoltre, eseguire la resezione dei tumori cerebrali dei roditori può essere difficile a causa della mancanza di strumenti o protocolli chirurgici clinicamente comparabili e dell’assenza diuna piattaforma 6 stabilita per la raccolta sistematica dei tessuti (Tabella 1).

Il presente protocollo mira a descrivere un paradigma standardizzato per la resezione del tumore cerebrale dei roditori e la conservazione dei tessuti utilizzando un sistema multifunzionale di resezione minimamente invasiva non ablativa (MIRS) e un sistema integrato di conservazione dei tessuti (TPS) (Figura 1). Si prevede che questa tecnica unica fornirà una piattaforma standardizzata che può essere utilizzata in vari studi nella ricerca preclinica per GBM e altri tipi di modelli di tumore cerebrale. I ricercatori che studiano le modalità terapeutiche o diagnostiche per i tumori cerebrali possono implementare questo protocollo per ottenere una resezione standardizzata nei loro studi.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall’Università del Maryland e dal Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6, di età compresa tra 6 e 8 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Sono state seguite tutte le normative di livello 2 (BSL-2), compreso l’uso di maschere, guanti e camici. 1. Impianto iniziale del tumor…

Representative Results

La resezione chirurgica con MIRS determina una significativa diminuzione del carico tumoraleNel gruppo con un carico tumorale più piccolo, il segnale bioluminescente medio basale era di 5,5e+006 fotoni/s ± 0,2e+006 nel sottogruppo sottoposto a resezione. Dopo la resezione, il segnale bioluminescente medio è diminuito a 3,09e+006 fotoni/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, test di Mann-Whitney)9 (Figura 2). Il segnale biolumines…

Discussion

La resezione del tumore è una pietra miliare dei piani di trattamento oncologico neurochirurgico per i tumori cerebrali di basso grado e di alto grado. La citoriduzione e il debulking del tumore sono correlati con il miglioramento della funzione neurologica e della sopravvivenza globale nei pazienti con tumori cerebrali 1,2,5,6. Sebbene i protocolli per la resezione chirurgica siano stati prec…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Materials

1 mL syringes BD 309628
15 mL conical tubes Corning 430052
200 proof ethanol PharmCo 111000200
5 mL pipettes CoStar 4487
70 micron filter Fisher 08-771-2
Accutase Millipore Sigma SIG-SCR005
Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) Covetrus 33198
Anesthesia System Patterson Scientific 78935903
Anesthesic Gas Waste Container Patterson Scientific 78909457
Bench protector underpad Covidien 10328
C57Bl/6, 6-8 week old mice Charles River Laboratories Strain Code 027
ChroMini Pro Moser Type 1591-Q
Collagenase-Dispase Roche #10269638001
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher
Countess II FL Hemacytometer Thermo Fisher A25750
Debris Removal Solution Miltenyi Biotech #130-109-398
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G
DMEM F12 media Corning 10-090-CV
DMEM media Corning 10-013-CV
DNAse I Sigma Aldrich #10104159001
Eppendorf tubes Posi-Click 1149K01
Euthanasia solution Henry Schein 71073
FBS Millipore Sigma F4135
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10437-028
Formalin Invitrogen INV-28906
Gauze Henry Schein 101-4336
hEGF PeproTech EC 100-15
Heparin Sigma H-3149
hFGF-b PeproTech EC 1001-18B
Induction Chamber Patterson Scientific 78933388
Isoflurane Covetrus 11695-6777-2
Isoflurane Vaporizer Patterson Scientific 78916954
Ketamine Covetrus 11695-0703-1
Kopf Stereotactic frame Kopf Instruments 5001
Lightfield Microscope BioTek Cytation 5
Microinjection Unit Kopf 5001
Micromotor drill Foredom F210418
MRI system Bruker 7T Biospec Avance III MRI Scanner
NICO Myriad System NICO Corporation
Ophthalmic ointment Puralube vet ointment
Papain Sigma Aldrich #P4762
PBS Invitrogen #14190250
PenStrep Millipore Sigma N1638
Percoll solution Sigma Aldrich  #P4937
Pipette controller Falcon A07260
Povidone-iodine solution Aplicare 52380-1905-08
Progesterone Sigma P-8783
Putrescine Sigma P-5780
RPMI Media Invitrogen INV-72400120
Scalpel blade Covetrus 7319
Scalpel handle Fine Science Tools 91003-12
Skin marker Time Out D538,851
Staple remover MikRon ACR9MM
Stapler MikRon ACA9MM
Staples Clay Adams 427631
Stereotactic Frame Kopf Instruments 5000
Sucrose Sigma Aldrich S9378
Suture, vicryl 4-0 Ethicon J494H
T-75 culture flask Sarstedt 83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) Lonza BP10-548E
Trypsin-EDTA Corning MDT-25-053-CI

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Alomari, S., Kedda, J., Malla, A. P., Pacis, V., Anastasiadis, P., Xu, S., McFarland, E., Sukhon, L., Gallo, B., Rincon-Torroella, J., Ben-Shalom, N., Ames, H. M., Brem, H., Woodworth, G. F., Tyler, B. Implementation of Minimally Invasive Brain Tumor Resection in Rodents for High Viability Tissue Collection. J. Vis. Exp. (183), e64048, doi:10.3791/64048 (2022).

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