Summary

Supplementazione lipidica per la longevità e analisi trascrizionale genica in Caenorhabditis elegans

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Il presente protocollo descrive i metodi di integrazione lipidica in colture liquide e su piastra per Caenorhabditis elegans, accoppiati con studi longitudinali e analisi trascrizionali geniche da bulk o da pochi vermi e tessuti di vermi.

Abstract

L’invecchiamento è un processo complesso caratterizzato da progressivi cambiamenti fisiologici derivanti da contributi sia ambientali che genetici. I lipidi sono cruciali nel costituire componenti strutturali delle membrane cellulari, immagazzinare energia e come molecole di segnalazione. La regolazione del metabolismo lipidico e della segnalazione è essenziale per attivare percorsi di longevità distinti. Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo eccellente e potente per analizzare il contributo del metabolismo lipidico e della segnalazione nella regolazione della longevità. Diversi studi di ricerca hanno descritto come l’integrazione dietetica di specifiche molecole lipidiche può prolungare la durata della vita di C. elegans ; Tuttavia, piccole differenze nelle condizioni di integrazione possono causare problemi di riproducibilità tra gli scienziati in diversi laboratori. Qui, due metodi di integrazione dettagliati per C. elegans sono segnalati impiegando l’integrazione lipidica sia con batteri seminati su piastre o sospensione batterica in coltura liquida. Qui sono forniti anche i dettagli per eseguire saggi di durata della vita con supplementazione lipidica permanente e analisi qRT-PCR utilizzando un lisato di verme intero o tessuti sezionati derivati da alcuni vermi. Utilizzando una combinazione di studi longitudinali e indagini trascrizionali sull’integrazione lipidica, i saggi di alimentazione forniscono approcci affidabili per analizzare come i lipidi influenzano la longevità e l’invecchiamento sano. Questa metodologia può anche essere adattata per vari approcci di screening nutrizionale per valutare i cambiamenti in un sottoinsieme di trascrizioni utilizzando un piccolo numero di tessuti sezionati o alcuni animali.

Introduction

Lipidi
I lipidi sono piccole molecole idrofobiche o anfipatiche solubili in solventi organici ma insolubili in acqua 1,2. Le molecole lipidiche distinte si differenziano l’una dall’altra in base al numero di atomi di carbonio contenuti nelle loro catene, alla posizione, al numero di doppi legami e alle strutture legate, tra cui glicerolo o fosfati. I lipidi svolgono ruoli cruciali all’interno e attraverso cellule distinte per regolare le funzioni dell’organismo, tra cui la costituzione di doppi strati di membrana, fornendo accumulo di energia e agendo come molecole di segnalazione 3,4.

In primo luogo, i lipidi sono componenti strutturali delle membrane biologiche, compresa la membrana plasmatica e le membrane subcellulari intracellulari che dividono i compartimenti interni dall’ambiente extracellulare. In secondo luogo, i lipidi sono la principale forma di accumulo di energia negli animali vertebrati e invertebrati. I lipidi neutri, compresi i triacilgliceroli, sono immagazzinati per un lungo periodo in vari tessuti, incluso il tessuto adiposo. Nel nematode Caenorhabditis elegans, l’intestino è il principale organo metabolico di deposito del grasso; La sua funzione non è solo coinvolta nella digestione e nell’assorbimento dei nutrienti, ma anche nel processo di disintossicazione, che assomiglia all’attività degli epatociti dei mammiferi. Altri tessuti di accumulo di grasso includono la linea germinale, in cui i lipidi sono essenziali per lo sviluppo degli ovociti, e l’ipoderma, che è composto da cellule epidermiche simili alla pelle 3,5. In terzo luogo, negli ultimi anni, ulteriori prove hanno suggerito che i lipidi sono potenti molecole di segnalazione coinvolte nella segnalazione intra ed extracellulare agendo direttamente su una varietà di recettori, compresi i recettori accoppiati a proteine G e nucleari, o indirettamente attraverso la modulazione della fluidità della membrana o le modifiche post-traduzionali 6,7,8,9 . Ulteriori studi continueranno a chiarire i meccanismi molecolari alla base della segnalazione lipidica nel promuovere la longevità e la durata della salute.

Gli organismi modello sono importanti per affrontare specifiche questioni biologiche che sono troppo complesse da studiare negli esseri umani. Ad esempio, il nematode C. elegans è un modello eccellente per condurre analisi genetiche per sezionare i processi biologici rilevanti per la nutrizione umana e la malattia10. I percorsi molecolari altamente conservati rilevanti per la fisiologia umana, i tessuti complessi, i modelli comportamentali e gli abbondanti strumenti di manipolazione genetica rendono C. elegans un notevole organismo modello11. Ad esempio, C. elegans è eccellente nell’inoltro di screening genetici per identificare geni fenotipo-specifici, così come negli screening genetici inversi a livello di genoma tramite interferenza RNA12.

Nei laboratori, i nematodi vengono coltivati su piastre di agar Petri seminate con un prato di batteri Escherichia coli, fornendo macronutrienti come proteine, carboidrati e acidi grassi saturi e insaturi come fonti di energia e mattoni e micronutrienti come co-fattori e vitamine13. Analogamente ai mammiferi, i nematodi sintetizzano molecole di acidi grassi sia dall’acido palmitico che dall’acido stearico (molecole sature a 16 e 18 atomi di carbonio, rispettivamente) che sono sequenzialmente desaturate e allungate in una varietà di acidi grassi monoinsaturi (MUFA) e acidi grassi polinsaturi (PUFA)14,15,16,17,18. È interessante notare che C. elegans è in grado di sintetizzare de novo tutti gli acidi grassi necessari e gli enzimi principali coinvolti nella biosintesi, nella desaturazione e nell’allungamento degli acidi grassi, facilitando la sintesi di PUFA a catena lunga19. A differenza di altre specie animali, C. elegans può convertire gli acidi grassi ω-6 a 18 e 20 atomi di carbonio in acidi grassi ω-3 con i propri enzimi ω-3 desaturasi. Inoltre, i vermi possiedono una Δ12 desaturasi che catalizza la formazione di acido linoleico (LA) dall’acido oleico (OA, 18:1)20,21. La maggior parte degli animali o delle piante mancano sia di Δ12 che di ω-3 desaturasi e quindi si basano sull’assunzione alimentare di ω-6 e ω-3 per ottenere i loro PUFA, mentre C. elegans non richiede acidi grassi alimentari22. Mutanti isolati privi di enzimi desaturasi funzionali sono stati utilizzati per studiare le funzioni di specifici acidi grassi in processi biologici distinti, tra cui riproduzione, crescita, longevità e neurotrasmissione. L’effetto dei singoli acidi grassi su specifici percorsi biologici può essere affrontato utilizzando sia un approccio genetico che un’integrazione dietetica16,17,23. Ad oggi, la ricerca sui lipidi si è concentrata sulla caratterizzazione dei geni coinvolti nella sintesi, degradazione, conservazione e rottura dei lipidi nelle condizioni neurologiche e di sviluppo24. Tuttavia, i ruoli dei lipidi nella regolazione della longevità stanno appena iniziando a essere rivelati.

Segnalazione lipidica nella regolazione della longevità
I lipidi svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della longevità attivando cascate di segnalazione cellulare in tessuti e tipi di cellule distinti. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo attivo dei lipidi nella modulazione della trascrizione e della comunicazione cellula-cellula attraverso proteine leganti i lipidi o il riconoscimento dei recettori di membrana25. Inoltre, l’integrazione lipidica dietetica offre uno strumento eccellente per sezionare come il metabolismo lipidico influenza la durata della vita in C. elegans. È stato dimostrato che MUFA e PUFA distinti promuovono la longevità attivando i fattori di trascrizione26,27.

I modelli di longevità, tra cui la segnalazione insulina / IGF-1 e l’ablazione delle cellule precursori della linea germinale, sono associati alla via di biosintesi MUFA e l’integrazione di MUFA, tra cui acido oleico, acido palmitoleico e cis-vaccenic, è sufficiente per estendere la durata della vita di C. elegans 26. Sebbene l’effetto longevità conferito dalla somministrazione di MUFA richieda ulteriori indagini, è probabile che il meccanismo sottostante sia mediato dal fattore di trascrizione SKN-1 / Nrf2, che è un attivatore chiave della risposta allo stress ossidativo e della regolazione della longevità28,29. Tra i MUFA, una particolare classe di etanolammidi acili grasse chiamate N-aciletanolammine (NAE) svolge ruoli cruciali in meccanismi distinti tra cui infiammazione, allergie, apprendimento, memoria e metabolismo energetico30. In particolare, la molecola lipidica nota come oleoiletanolamide (OEA) è stata identificata come regolatore positivo della longevità promuovendo la traslocazione della proteina legante i lipidi 8 (LBP-8) nel nucleo per attivare i recettori ormonali nucleari NHR-49 e NHR-807. L’integrazione dell’analogo OEA KDS-5104 è sufficiente per prolungare la durata della vita e induce l’espressione di geni coinvolti nelle risposte allo stress ossidativo e nella β-ossidazione mitocondriale 7,8.

Allo stesso tempo, il ruolo dei PUFA è stato anche collegato alla regolamentazione della longevità. La somministrazione di acido grasso PUFA ω-3 acido α-linolenico (ALA) promuove la longevità attivando i fattori di trascrizione NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF e inducendo la β-ossidazione mitocondriale31. È interessante notare che i prodotti perossidati di ALA, indicati come ossilipine, attivano SKN-1 / NRF, suggerendo che sia i PUFA che i loro derivati ossidativi possono conferire benefici di longevità23. L’integrazione dell’acido grasso ω-6 acido arachidonico (AA) e dell’acido diomo-γ-linolenico (DGLA) prolunga la durata della vita attraverso l’attivazione dell’autofagia, promuovendo il controllo della qualità delle proteine e determinando la degradazione degli aggregati proteici sprecati e tossici27,32. Più recentemente, una regolazione del segnale cellulare non autonoma mediata dalla proteina legante i lipidi 3 (LBP-3) e DGLA ha dimostrato di essere cruciale per promuovere la longevità inviando segnali periferici ai neuroni, suggerendo un ruolo a lungo raggio delle molecole lipidiche nella comunicazione intertissutale a livelli sistemici33. Il presente studio riporta ogni fase per eseguire l’integrazione lipidica con batteri seminati su piastre o sospensione batterica in coltura liquida. Queste metodologie sono utilizzate per valutare la durata della vita e l’analisi trascrizionale, impiegando il contenuto di tutto il corpo o tessuti sezionati derivati da alcuni vermi. Le seguenti tecniche possono essere adattate a una varietà di studi nutrizionali e offrono un valido strumento per analizzare come il metabolismo lipidico influenza la longevità e l’invecchiamento sano.

Protocol

La Figura 1 mostra uno schema dell’alimentazione lipidica utilizzando diverse impostazioni sperimentali. 1. Preparazione di batteri lipidici condizionati Preparare la soluzione di base di restrizione dietetica di diluizione batterica (BDR) sciogliendo 5,85 g di NaCl, 1,0 g di K 2 HPO 4 e 6,0 g diKH2PO4 (vedere Tabella dei materiali) in 999 ml di acqua deionizzata. Regolare il p…

Representative Results

Validazione dei cambiamenti trascrizionali utilizzando alcuni vermi interi dopo l’integrazione lipidicaPer indagare se il protocollo per estrarre e retrotrascrivere l’RNA in cDNA da pochi vermi interi è riproducibile e confrontabile con i dati dei vermi sfusi, è stato impiegato un ceppo di vermi di lunga durata che sovraesprime l’acido lisosomiale lipasi lipl-4 nell’intestino 7,8,33,35….

Discussion

L’integrazione lipidica è stata impiegata nella ricerca sull’invecchiamento per chiarire l’impatto diretto di alcune specie lipidiche sull’invecchiamento sano 6,7,23,26,27,31. Tuttavia, la procedura di integrazione lipidica può essere impegnativa e qualsiasi incoerenza tra gli esperimenti può causare risultati non riproduc…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo P. Svay per il supporto alla manutenzione. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (MCW) e NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (MS). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).

Materials

1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

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Citazione di questo articolo
Savini, M., Lee, Y., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

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