Summary

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Published: August 01, 2022
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Summary

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l’immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell’imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Abstract

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l’imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l’analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L’imaging dell’intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L’uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.

Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all’interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l’imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l’immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell’immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.

Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell’organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

Introduction

L’imaging dell’intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un’analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto 1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; tuttavia, queste tecniche richiedono attrezzature costose e specializzate, potrebbero non essere compatibili con l’immunomarcatura e la natura bidimensionale (2D) di alcuni metodi può portare a danni tissutali e taglio durante il sezionamento 4,5.

I recenti progressi hanno fornito un approccio alternativo per l’imaging di interi cervelli che non richiede il sezionamento dei tessuti; Implicano l’uso della pulizia dei tessuti per rendere trasparente il cervello. La trasparenza si ottiene nella maggior parte dei metodi di pulizia dei tessuti sia rimuovendo i lipidi, in quanto sono una delle principali fonti di diffusione della luce, sia abbinando l’indice di rifrazione (RI) dell’oggetto con il RI della soluzione di immersione del campione durante l’imaging. La luce può quindi passare attraverso il confine tra i materiali senza essere dispersa 6,7,8,9.

I metodi di pulizia dei tessuti, come iDISCO+, sono spesso combinati con l’imaging 3D rapido utilizzando la microscopia a eccitazione a singolo fotone, come LSFM 6,7,10. All’interno di tessuti trasparenti marcati con un fluoroforo, la microscopia a fluorescenza a foglio di luce immagini sezioni per eccitazione con un sottile piano di luce11. Il vantaggio principale di LSFM è che una singola sezione ottica viene illuminata alla volta, con tutta la fluorescenza delle molecole all’interno di quella sezione eccitata, il che riduce al minimo il fotosbiancamento. Inoltre, l’imaging di un’intera fetta ottica consente il rilevamento basato su telecamera di quella fetta eccitata, aumentando la velocità rispetto alla scansione puntuale12. LSFM produce in modo non distruttivo sezioni ottiche ben registrate che sono adatte per la ricostruzione 3D.

Mentre il metodo iDISCO+ consente una pulizia dei tessuti economica entro ~ 3 settimane, le fasi di disidratazione all’interno del protocollo possono portare al restringimento del tessuto e alla potenziale alterazione della morfologia del campione, influenzando così le misurazioni volumetriche 6,10. L’aggiunta di un metodo di imaging secondario, come la risonanza magnetica, da utilizzare prima della procedura di pulizia del tessuto può misurare il grado di restringimento indotto dalla pulizia del tessuto attraverso il campione. Durante le fasi di disidratazione, le differenze nelle proprietà meccaniche tra la materia grigia e bianca possono portare a deformazioni non uniformi della materia cerebrale, con conseguenti deformazioni di volume indotte dalla pulizia dei tessuti dissimili tra campioni wild-type e mutanti e possono confondere le interpretazioni delle differenze volumetriche in questi campioni10,13 . La risonanza magnetica viene eseguita prima perfondendo l’animale con un agente di contrasto (ad esempio, gadolinio), seguita dall’incubazione del tessuto estratto di interesse in una soluzione di immersione (ad esempio, fomblin) prima di imaging14. La risonanza magnetica è compatibile con la pulizia dei tessuti e l’esecuzione di LSFM sullo stesso campione.

LSFM viene spesso utilizzato per creare immagini di microscopia su larga scala per la visualizzazione qualitativa del tessuto cerebrale di interesse piuttosto che la valutazione quantitativa della struttura cerebrale (Figura 1). Senza una valutazione quantitativa, è difficile dimostrare differenze strutturali derivanti da insulti genetici o ambientali. Con il miglioramento delle tecnologie di pulizia dei tessuti e di imaging, insieme alla riduzione dei costi di archiviazione e potenza di calcolo, la quantificazione delle localizzazioni dei tipi di cellule all’interno del tessuto di interesse sta diventando più accessibile, consentendo a più ricercatori di includere questi dati nei loro studi.

Con oltre 100 milioni di cellule nel cervello del topo15 e sessioni di imaging dell’intero cervello in grado di generare terabyte di dati, vi è una crescente domanda di strumenti avanzati di analisi delle immagini che consentano una quantificazione accurata delle caratteristiche all’interno delle immagini, come le cellule. Esistono numerosi metodi di segmentazione per le immagini con eliminazione tissutale che applicano soglie per l’intensità della colorazione nucleare e filtrano oggetti con forme, dimensioni o densità predefinite10,16,17,18. Tuttavia, interpretazioni imprecise dei risultati possono derivare da variazioni di parametri quali dimensioni delle celle, contrasto dell’immagine e intensità dell’etichettatura. Questo articolo descrive il nostro protocollo stabilito per quantificare i nuclei cellulari nel cervello del topo. In primo luogo, descriviamo in dettaglio i passaggi per la raccolta dei tessuti del cervello del topo P4, seguiti da un protocollo di pulizia dei tessuti e immunoetichettatura ottimizzato dal metodo iDISCO +10 disponibile pubblicamente. In secondo luogo, descriviamo l’acquisizione delle immagini utilizzando la risonanza magnetica e la microscopia a foglio leggero, compresi i parametri utilizzati per l’acquisizione delle immagini. Infine, descriviamo e dimostriamo NuMorph19, una serie di strumenti di analisi delle immagini che il nostro gruppo ha sviluppato che consente la quantificazione specifica del tipo di cellula dopo la pulizia dei tessuti, l’immunomarcatura con marcatori nucleari e l’imaging a foglio luminoso di regioni annotate.

Protocol

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità e approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l’Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. 1. Dissezione e perfusione del topo NOTA: Le seguenti dissezioni sono state eseguite su topi P4 e P14 utilizzando una siringa. Il volume del liquido di perfusione varierà a seconda dell’età dell’animale. PerfusioneATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è una …

Representative Results

Poiché il protocollo iDISCO+ introduce un significativo restringimento tissutale, che è facilmente visibile ad occhio nudo (Figura 2B), abbiamo aggiunto una fase di risonanza magnetica a questa pipeline prima della pulizia dei tessuti per quantificare il restringimento indotto dalla pulizia dei tessuti. Il flusso di lavoro inizia con la rimozione del tessuto non cerebrale dall’immagine MR (Figura 2C). Successivamente, viene applicata una trasformazione rigida …

Discussion

I metodi di pulizia dei tessuti sono tecniche utili per misurare l’organizzazione cellulare 3D del cervello. Ci sono una miriade di metodi di pulizia dei tessuti descritti in letteratura, ognuno con i suoi vantaggi e limiti 6,7,8,9. Le opzioni per gli strumenti computazionali per analizzare i tipi di cellule nelle immagini tessutali sono relativamente limitate. Altri strumenti disponibili sono …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 a JLS e R01NS110791 a GW) e dalla Foundation of Hope. Ringraziamo Pablo Ariel del Laboratorio Servizi di Microscopia per l’assistenza nell’imaging dei campioni. Il Laboratorio di Servizi di Microscopia presso il Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio è supportato in parte dal Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 al Lineberger Comprehensive Cancer Center dell’Università della Carolina del Nord (UNC). Il nucleo di microscopia neuroscientifica è supportato dalla sovvenzione P30 NS045892. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata in parte dal North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

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