Il presente protocollo descrive una tecnica di compensazione per i germogli di riso, che sono difficili da preparare per le osservazioni strutturali interne a causa della natura dura, spessa o stratificata dei tessuti. Questo metodo facilita osservazioni continue e profonde di fluorescenza, anche in piante di riso adulte.
La tecnologia di clearing recentemente sviluppata che elimina i disallineamenti dell’indice di rifrazione e diminuisce il materiale auto-fluorescente ha permesso di osservare i tessuti vegetali in tre dimensioni (3D) preservando le loro strutture interne. Nel riso (Oryza sativa L.), una pianta modello monocotiledone e una coltura importante a livello globale, la tecnologia di pulizia è stata riportata in organi relativamente facili da osservare, come le radici e le foglie. Sono state riportate anche applicazioni della tecnologia di clearing nel meristema apicale (SAM) e negli steli, ma solo in misura limitata a causa della scarsa penetrazione della soluzione di compensazione (CS) in questi tessuti. La limitata efficienza delle soluzioni di compensazione in questi tessuti è stata attribuita all’autofluorescenza, all’ispessimento e all’indurimento dei tessuti nello stelo mentre i fasci vascolari e l’epidermide si sviluppano e alla stratificazione del SAM con foglie idrorepellenti. Il presente protocollo riporta l’ottimizzazione di un approccio di clearing per l’osservazione continua e 3D dell’espressione genica dalla pannocchia SAM/giovane alla base dei germogli durante lo sviluppo. I campioni di tessuto fissi che esprimono un reporter proteico fluorescente sono stati tagliati in sezioni utilizzando una micro-affettatrice vibrante. Quando è stato raggiunto uno spessore appropriato, è stato applicato il CS. Prendendo di mira specificamente il tessuto centrale, il tasso di penetrazione e l’uniformità del CS sono aumentati e il tempo necessario per rendere il tessuto trasparente è diminuito. Inoltre, la pulizia delle sezioni tagliate ha permesso l’osservazione della struttura interna dell’intero servizio fotografico da una prospettiva macro. Questo metodo ha potenziali applicazioni nell’imaging profondo di tessuti di altre specie vegetali difficili da eliminare.
La tecnologia di pulizia recentemente sviluppata ha permesso di osservare i tessuti profondi delle piante preservando la loro struttura interna 1,2,3. Nell’impianto modello di dicot Arabidopsis, sono stati condotti molti studi sull’imaging delle proteine fluorescenti utilizzando la tecnologia di compensazione per eliminare i disallineamenti dell’indice di rifrazione e rimuovere i materiali auto-fluorescenti 4,5,6. Sebbene l’uso della tecnologia di clearing7,8 e l’imaging 3D a risoluzione cellulare9 siano stati riportati nel riso (Oryza sativa L.), una pianta modello monocotiledone e una coltura importante a livello globale, questi sono limitati a organi relativamente sottili e morbidi, come radici, foglie e meristema apicale (SAM), che sono facili da osservare.
Il germoglio è l’organo principale che costituisce le parti fuori terra delle piante vascolari. Nel riso, i germogli sono composti da una serie di “fitomeri” impilati verticalmente, comprendenti gemme ascellari, foglie e il gambo10. Sulla punta delle riprese, il SAM è composto da cellule staminali indifferenziate al centro. I fitomeri sono formati dalla differenziazione delle cellule derivate dal SAM. Dopo che le piante passano dalla fase vegetativa a quella riproduttiva, gli steli di riso si allungano e il SAM si differenzia in giovani pannocchie10. Questo cambiamento dello sviluppo è accompagnato da fluttuazioni nell’espressione di vari geni negli steli e nelle pannocchie SAM / giovani. Per comprendere i meccanismi alla base della differenziazione cellulare in vari tessuti, è importante osservare strutturalmente la morfologia cellulare e l’espressione genica nei tessuti germogli interni. Tuttavia, l’imaging profondo degli steli (nodi e internodi) nelle riprese rappresenta una sfida a causa dell’inefficienza delle soluzioni di pulizia per penetrare nel tessuto. Gli steli subiscono immediatamente un rapido aumento di volume dalla crescita laterale dopo la differenziazione dal SAM. L’indurimento dei tessuti dei nodi del riso dovuto all’ispessimento dei fasci vascolari e il legame complesso orizzontale dell’anastomosi vascolare nodale, oltre all’elevata repellenza dei germogli di riso, contribuiscono tutti a limitare la penetrazione del CS negli steli10.
Questo studio mirava a osservare i cambiamenti nell’espressione genica nei tessuti dei germogli di riso utilizzando una tecnica strutturale di fluorescenza profonda. Questo lavoro ottimizza un protocollo di compensazione per il riso per osservare continuamente l’espressione genica dalla pannocchia SAM / giovane alla base in una struttura 3D, piuttosto che su una superficie piana, utilizzando un microscopio laser confocale.
Passaggi critici del protocollo
I passaggi critici in questo protocollo sono la fissazione e il taglio. I germogli di riso hanno tessuti duri, spessi o stratificati che limitano la penetrazione della soluzione fissativa. Per migliorare la permeabilità della soluzione fissativa, un lato del tessuto è stato rasato sottilmente al campionamento, come mostrato nella Figura 1E-F. Inoltre, i trattamenti sottovuoto sono stati ripetuti due volte utilizzando una pressione più elevata. Inoltre, i campioni sono stati fissati per una notte a 4 °C invece della consueta fissazione di 2 ore a 4 °C.
Il punto chiave nella fase di taglio è determinare lo spessore dei tessuti da preparare per osservare le proteine fluorescenti preservando la loro struttura interna dopo un breve periodo di trattamento CS. Come mostrato nella Figura 2C, i campioni spessi 1 mm, tagliati a mano il più sottili possibile, sono diventati trasparenti solo in un numero limitato di tessuti anche dopo 3 mesi di trattamento CS. Pertanto, la fase di taglio è essenziale per l’osservazione della fluorescenza profonda dei germogli di riso adulti. In questo studio, i campioni sono stati tagliati a uno spessore di 130 μm, come mostrato nella Figura 2D. Lo spessore di 130 μm ha permesso di liberare le foglie dopo 1 settimana di trattamento CS e l’intero campione dopo 2 settimane. In questo studio sono stati utilizzati germogli di riso adulti al 9-10 LS. I tessuti spessi ma più morbidi dei germogli di riso più giovani possono essere eliminati più velocemente con il trattamento CS. Lo spessore dei campioni e la durata del trattamento CS devono essere regolati in base al tipo di tessuto, alle condizioni e allo spessore della struttura 3D da osservare.
Modifiche e metodi di risoluzione dei problemi
Il CS precipitava facilmente a basse temperature. Il CS precipitato non può preservare le proteine fluorescenti; Pertanto, è necessario prestare attenzione quando si conservano i campioni alla temperatura corretta. Inoltre, sia il CS che la soluzione fissativa non hanno alcun effetto antisettico; Pertanto, le proteine fluorescenti saranno degradate se contaminate. Il riso coltivato nel suolo è soggetto a crescita fungina; Pertanto, il campionamento e la manipolazione dei campioni devono essere eseguiti con cura per evitare la contaminazione.
I coloranti fluorescenti in eccesso nel tampone possono emettere fluorescenza di fondo e interferire con le osservazioni microscopiche. Ad esempio, in precedenza veniva utilizzata una soluzione bianca di calcofluor contenente colorante blu Evans. Dopo la colorazione per 1 ora e il lavaggio per 1 ora, le proteine fluorescenti di OsMADS15-mOrange sono state osservate utilizzando un laser a 555 nm. Tuttavia, le proteine fluorescenti non potevano essere osservate a causa della fluorescenza di fondo derivata dal colorante blu di Evans. Questa fluorescenza di fondo è stata quasi eliminata lavando i campioni per 2 ore. Inoltre, le proteine fluorescenti erano più chiare se i campioni venivano lasciati durante la notte. Pertanto, in questo studio è stata utilizzata una soluzione bianca di calcofluor puro. La fluorescenza di fondo derivata dal colorante fluorescente deve essere controllata utilizzando diverse lunghezze d’onda laser prima delle osservazioni.
Limitazioni del metodo
Come mostrato nella Figura 3, sono state osservate proteine fluorescenti profonde nei campioni spessi 130 μm dopo 2 settimane di trattamento con CS. Ciò è coerente con i risultati mostrati nella Figura 2D, dove il campione spesso 130 μm è diventato trasparente dopo 2 settimane di trattamento con CS. Tuttavia, come mostrato nella Figura 3A, l’autofluorescenza del citoplasma era ancora evidente nei linfonodi dopo 2 settimane ed è stata completamente rimossa solo dopo 4 settimane di trattamento con CS. I nodi hanno un’alta densità di celle e, pertanto, richiedono un tempo più lungo per rimuovere i materiali auto-fluorescenti.
Come mostrato nella Figura 3C, sono state osservate proteine fluorescenti profonde nelle foglie senza trattamento CS, ma la luminosità era più debole di quella nei nodi e negli internodi alla stessa profondità di 20 μm. Dopo 1 settimana di trattamento con CS, le proteine fluorescenti erano più luminose. La clorofilla è abbondante nelle foglie e assorbe 488 nm di luce di eccitazione. Hanno anche autofluorescenza arancione / rossa, che può interferire con l’osservazione di proteine fluorescenti utilizzando un laser a 555 nm. Dopo 1 settimana di trattamento CS, la clorofilla e altri materiali auto-fluorescenti sono stati rimossi, ottenendo immagini ad alto rapporto segnale-rumore.
Le profondità che potevano essere osservate nei tessuti dopo 2 settimane e 4 settimane di trattamento con CS non erano significativamente diverse, sebbene le proteine fluorescenti apparissero più deboli dopo 4 settimane (Figura 3). Normalmente, la luminosità delle proteine fluorescenti e l’autofluorescenza si indeboliscono con il tempo, con un conseguente rapporto segnale-rumore più elevato. Pertanto, le proteine fluorescenti possono essere osservate più chiaramente regolando le condizioni microscopiche e l’elaborazione delle immagini. Sulla base di questi risultati, si è concluso che 2 settimane di trattamento con CS potrebbero facilitare l’osservazione delle proteine fluorescenti profonde, date le condizioni del nostro campione. Tuttavia, sono necessarie 4 settimane per osservare immagini più chiare che escludono completamente i materiali auto-fluorescenti.
Le strutture con forte autofluorescenza, come i fasci vascolari e le cellule multi-braccio, non possono essere eliminate nel CS. Per osservare queste strutture senza autofluorescenza, è necessario utilizzare un metodo di time-gating12 o ottenere immagini mediante spettroscopia dello spettro di fluorescenza. Un microscopio a due fotoni può essere più adatto per osservare tessuti più profondi se si osservano tessuti più spessi.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti e alternativi
Generalmente, le strutture interne delle piante di riso sono state osservate utilizzando il sezionamento criostato o vibratomo. Un criostato è adatto per preparare sezioni sottili, che consentono un’osservazione più facile, ma la preparazione dei campioni e il funzionamento dell’apparecchiatura richiedono molto tempo. Anche ricostruire la struttura 3D originale da sezioni sottili è difficile. La vibratoma è relativamente facile da usare e adatta alla produzione di sezioni spesse. Tuttavia, sezioni spesse di tessuti bersaglio consentono solo osservazioni della superficie tagliata e non tessuti profondi che la luce non può raggiungere. Per questi motivi, nessuno dei due metodi è adatto per osservazioni di fluorescenza profonda.
Questo studio ha affrontato le sfide nell’osservazione della fluorescenza profonda nei germogli di riso, come la limitata penetrazione tissutale del CS e la scarsa risoluzione dell’oggetto al microscopio confocale, combinando i metodi esistenti. Come mostrato nella Figura 4, abbiamo osservato proteine fluorescenti (OsMADS15-mOrange) espresse nei tessuti profondi dei germogli di riso adulti dalla giovane pannocchia alla base. La Figura 4D si concentra sul fiore e mostra proteine fluorescenti profonde a intervalli di 3 μm. Tessuti di profondità superiore a -130 μm sono stati osservati dopo 2 settimane di trattamento con CS, ma solo i tessuti entro -27 μm di profondità sono stati osservati (dati non mostrati) nel fiore alla stessa dimensione e stadio di crescita senza trattamento CS. L’attuale protocollo migliorato ha permesso l’osservazione non solo della sovraespressione dei geni, ma anche dell’espressione genica naturale nei tessuti profondi dei germogli di riso adulti.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo in specifiche aree di ricerca
Questo protocollo, che ottimizza l’osservazione della fluorescenza profonda dei germogli di riso adulti, consente l’eliminazione efficiente di tessuti duri, spessi o stratificati tagliando i tessuti non necessari e aumentando la permeabilità del CS. Inoltre, lo spessore dei campioni per l’analisi è stato ottimizzato per consentire l’osservazione continua e strutturale della fluorescenza profonda utilizzando un microscopio laser confocale, che normalmente non può risolvere tessuti spessi o opachi.
È difficile confrontare campioni di riso in diversi stadi di crescita perché le proteine fluorescenti si degradano nel tempo nelle soluzioni fissative e PBS. Tuttavia, le proteine fluorescenti nel CS possono essere conservate per più di 5 mesi1. La lunga durata di conservazione del CS è un grande vantaggio per l’osservazione della fluorescenza profonda nel riso.
Recentemente, sono state sviluppate molte tecnologie di pulizia, che consentono di osservare i tessuti profondi in 3D preservando le loro strutture interne. Queste tecnologie hanno continuato ad evolversi e sono state sviluppate nuove soluzioni di compensazione. Un buon esempio è iTOMEI14, che consente un’efficiente rimozione della clorofilla e un rilevamento della fluorescenza più brillante. Un altro esempio è ClearSeeAlpha15, che impedisce l’imbrunimento dei tessuti durante il trattamento di pulizia e li fa apparire trasparenti. La combinazione di queste soluzioni di compensazione con il metodo attuale può consentire una compensazione più efficiente ed efficace.
Si prevede che il metodo attuale aiuterà a ottenere nuove conoscenze attraverso l’imaging approfondito non solo del riso ma anche di altre piante.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dr. R. Terada, il Dr. Z. Shimatani e il Dr. H. Tsuji per averci fornito i semi OsMADS15-mOrange; Dr. D. Kurihara per averci fornito la costruzione NGCN; e il Dr. R. Shim per aver modificato il nostro manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione JP20H05912, 20H05778, 20H05779) e dal programma SATREPS (no. JPMJSA1706) del GVC e JICA.
1.5 mL microcentrifuge tube | BIO-BIK | ST-0150F | |
12-multiwell plate | Corning | 353043 | |
50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
Calcofluor white solution | Sigma-Aldrich | 910090 | |
ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | This can be made or purchased. |
Confocal laser microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Desiccator | SANPLATEC | Custom made of acrylic. 30 cm (L), 30 cm (W), 14.5 cm (H) | |
Glass coverslip (18 × 18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
Microscope slide (76 × 26) | MATSUNAMI | S2441 | |
Paraffin film | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | provided by Dr. Kurihara | ||
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | AS One | AS-01 | |
Vibrating micro-slicer | DOSAKA | DTK-3000 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |