Summary

Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l’enterocolite necrotizzante.

Abstract

Gli enteroidi sono uno strumento di ricerca emergente nello studio delle malattie infiammatorie intestinali come l’enterocolite necrotizzante (NEC). Sono tradizionalmente coltivati nella conformazione basolaterale-out (BO), dove la superficie apicale della cellula epiteliale è rivolta verso il lume interno. In questo modello, l’accesso alla superficie luminale degli enteroidi per il trattamento e la sperimentazione è impegnativo, il che limita la capacità di studiare le interazioni ospite-patogeno. Per aggirare questo, è stato creato un modello apical-out (AO) neonatale per l’enterocolite necrotizzante. Poiché i cambiamenti di permeabilità delle cellule epiteliali intestinali sono patognomonici per NEC, questo protocollo delinea l’uso del giallo lucifero (LY) come marker di permeabilità paracellulare. LY attraversa la barriera epiteliale intestinale attraverso tutte e tre le principali vie paracellulari: poro, perdita e senza restrizioni. L’utilizzo di LY in un modello AO consente uno studio più ampio della permeabilità in NEC. Dopo l’approvazione dell’IRB e il consenso dei genitori, sono stati raccolti campioni chirurgici di tessuto intestinale da neonati pretermine umani. Le cellule staminali intestinali sono state raccolte tramite isolamento della cripta e utilizzate per far crescere enteroidi. Gli enteroidi sono stati coltivati fino alla maturità e poi trasformati AO o lasciati in conformazione BO. Questi non sono stati trattati (controllo) o sono stati trattati con lipopolisaccaride (LPS) e sottoposti a condizioni ipossiche per l’induzione di NEC in vitro . LY è stato utilizzato per valutare la permeabilità. La colorazione immunofluorescente della proteina apicale zonula occludens-1 e della proteina basolaterale β-catenina ha confermato la conformazione AO. Sia gli enteroidi AO che BO trattati con LPS e ipossia hanno dimostrato un aumento significativo della permeabilità paracellulare rispetto ai controlli. Entrambi gli enteroidi AO e BO hanno mostrato un maggiore assorbimento di LY nel lume degli enteroidi trattati rispetto ai controlli. L’utilizzo di LY in un modello enteroide AO consente lo studio di tutte e tre le principali vie di permeabilità paracellulare. Consente inoltre lo studio delle interazioni ospite-patogeno e di come ciò possa influenzare la permeabilità rispetto al modello enteroide BO.

Introduction

Gli enteroidi sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali intestinali umane limitate all’organo 1,2. Sono costituiti interamente da linee epiteliali e contengono tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali differenziate2. Gli enteroidi mantengono anche la polarità cellulare costituita da una superficie luminale apicale che forma un compartimento interno e una superficie basolaterale rivolta verso il mezzo circostante. Gli enteroidi sono un modello unico in quanto preservano le caratteristiche dell’ospite da cui sono stati generati3. Pertanto, gli enteroidi generati da neonati umani prematuri rappresentano un modello utile per studiare le malattie che colpiscono principalmente questa popolazione, come l’enterocolite necrotizzante (NEC).

Il modello enteroide tradizionale viene coltivato in una conformazione basolaterale-out (BO), dove l’enteroide è racchiuso in una cupola di matrice di membrana basale (BMM). BMM induce l’enteroide a mantenere una struttura 3D con la superficie basolaterale all’esterno. Gli enteroidi BO sono un modello adatto per NEC che colma il divario tra le linee cellulari umane primarie bidimensionali (2D) e i modelli animali in vivo 2,4. NEC è indotta negli enteroidi inserendo agenti patogeni come LPS o batteri nei mezzi che circondano gli enteroidi, seguita dall’esposizione a condizioni ipossiche 2,3. La sfida con il modello NEC enteroide BO è che non consente lo studio efficace delle interazioni ospite-patogeno, che si verificano sulla superficie apicale in vivo. I cambiamenti nella permeabilità intestinale sono dovuti a queste interazioni ospite-patogeno. Per comprendere meglio come la permeabilità influisce sulle basi fisiopatologiche della malattia, è necessario creare un modello che preveda il trattamento della superficie apicale.

Co et al. sono stati i primi a dimostrare che gli enteroidi BO maturi possono essere indotti a formare una conformazione apical-out (AO) rimuovendo le cupole BMM e risospendendole in media5. Questo articolo ha dimostrato che gli enteroidi AO mantenevano la corretta polarità epiteliale, contenevano tutti i tipi di cellule intestinali, sostenevano la barriera epiteliale intestinale e consentivano l’accesso alla superficie apicale5. L’utilizzo di enteroidi AO come modello NEC consente di ottenere una riproduzione fisiologica del processo patologico e lo studio delle interazioni ospite-patogeno.

Uno dei principali contributi alla fisiopatologia della NEC è l’aumento della permeabilità intestinale6. Diverse molecole sono state proposte come un modo per testare la permeabilità intestinale in vitro7. Tra questi, il giallo lucifero (LY) è un colorante idrofilo con picchi di eccitazione ed emissione a 428 nm e 540 nm, rispettivamente8. Mentre attraversa tutte le principali vie paracellulari, è stato utilizzato per valutare la permeabilità paracellulare in varie applicazioni, tra cui le barriere epiteliali emato-encefaliche e intestinali 8,9. L’applicazione tradizionale di LY utilizza cellule coltivate in monostrati su una superficie semipermeabile10. LY viene applicato sulla superficie apicale e attraversa attraverso proteine paracellulari a giunzione stretta per riunirsi sul lato basolaterale. Concentrazioni più elevate di LY nel compartimento basolaterale indicano una diminuzione delle proteine a giunzione stretta con conseguente rottura della barriera cellulare epiteliale intestinale e aumento della permeabilità10. È stato anche descritto in modelli enteroidi BO 3D in cui LY è stato aggiunto al supporto e singoli enteroidi sono stati ripresi per l’assorbimento di LY nel lume11. Sebbene ciò consenta l’analisi qualitativa tramite la visualizzazione dell’assorbimento di LY, l’analisi quantitativa è limitata. Questo protocollo delinea una tecnica unica che utilizza LY per valutare la permeabilità paracellulare utilizzando un modello enteroide NEC in vitro in enteroidi AO mantenendo l’orientamento 3D. Questo metodo può essere utilizzato per l’analisi sia qualitativa che quantitativa della permeabilità.

Protocol

La presente ricerca è stata eseguita in conformità con l’approvazione dell’Institutional Review Board (IRB, # 11610, 11611) presso l’Università dell’Oklahoma. Il consenso dei genitori era richiesto prima di raccogliere campioni chirurgici umani secondo le specifiche IRB. A seguito dell’approvazione dell’IRB e del consenso dei genitori, il tessuto intestinale tenue umano è stato ottenuto da neonati (età gestazionale corretta (GA) compresa tra 36 e 41 settimane al momento della raccolta del campione, tutti con una sto…

Representative Results

Conformazione AOGli enteroidi sospesi in mezzi LWRN al 50% per 72 ore assumono una conformazione AO (Figura 1). Ciò è stato confermato tramite colorazione immunofluorescente utilizzando supporti interi enteroidi della proteina apicale, zonula occludens-1 (ZO-1), e della proteina basolaterale, β-catenina (Figura 1). Gli enteroidi AO mostrano ZO-1 (verde) sulla superficie apicale esterna dell’enteroide, mentre la β-catenina (rossa…

Discussion

La permeabilità intestinale è complessa e riflette la funzione della barriera epiteliale. La barriera intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali che media il trasporto transcellulare e paracellulare14. La permeabilità paracellulare si basa su proteine a giunzione stretta che sigillano lo spazio tra le cellule epiteliali14. All’interno di questo trasporto paracellulare, ci sono tre percorsi distinti attraverso i quali le molecole possono attraversarsi: …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Ashley Nelson dell’Università di Rochester Medical Center per il suo aiuto strumentale con il nostro modello enteroide. Vorremmo anche ringraziare la Divisione di Chirurgia Pediatrica dell’Università dell’Oklahoma per il loro sostegno a questo progetto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], dall’Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research e dal Presbyterian Health Foundation Grant # 20180587 assegnato al Dipartimento di Chirurgia presso l’Università dell’Oklahoma Health Sciences Center.

Materials

[leu] 15-gastrin 1 Millipore Sigma G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer Corning 431752
100% LWRN conditioned media Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate Corning 3526
96-well black, clear bottom plate Greiner Bio-One 655090
A-83-01 R&D Systems 2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 Invitrogen A-11032
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 Cell Signaling #D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 Cell Signaling #14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 17504-044
Barrier PAP pen Scientific Device Laboratory 9804-02
BMM (Matrigel) Corning CB-40230C
Cell Recovery Solution Corning 354270
Dissecting scissors
DMEM Thermo Fisher Scientific 11-965-118
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320-082
DPBS Thermo Fisher Scientific 14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore Sigma GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system Invitrogen AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-525
Fluoroshield with DAPI Millipore Sigma F6057-20mL
Forceps
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050-061
GraphPad Prism 9 Dotmatics
Insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt Invitrogen L453
Modular incubator chamber Billups Rothenberg Inc. MIC101
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) Thermo Fisher Scientific 15630-080
N-Acetylcysteine Millipore Sigma A9165-5G
Nicotinamide Millipore Sigma N0636-100G
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093
SB202190 Millipore Sigma S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader Molecular devices
Tube Revolver Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate Corning 3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI) Tocris 1254

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Liebe, H., Schlegel, C., Cai, X., Golubkova, A., Leiva, T., Berry, W. L., Hunter, C. J. Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model. J. Vis. Exp. (185), e64215, doi:10.3791/64215 (2022).

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