In questo lavoro, un approccio di ricostituzione in vitro è impiegato per studiare la poroelasticità dei gel di actomiosina di condizioni controllate. Viene quantificata la dinamica del gel di actomiosina e del solvente incorporato, attraverso la quale viene dimostrata la poroelasticità della rete. Discutiamo anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.
Le cellule possono cambiare attivamente le loro forme e diventare mobili, una proprietà che dipende dalla loro capacità di riorganizzare attivamente la loro struttura interna. Questa caratteristica è attribuita alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori di miosina e proteine accessorie che presentano proprietà di contrazione intrinseca. La visione solitamente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico. Tuttavia, questo modello non può sempre spiegare i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un’immagine che descrive il citoscheletro come un materiale attivo poroelastico, una rete elastica incorporata con citosol. I gradienti di contrattilità generati dai motori della miosina guidano il flusso del citosol attraverso i pori del gel, che deduce che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati. Una caratteristica principale della poroelasticità è il rilassamento diffusivo delle tensioni nella rete, caratterizzato da un’efficace costante di diffusione che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità e dalla viscosità del citosol (solvente). Poiché le cellule hanno molti modi per regolare la loro struttura e le proprietà dei materiali, la nostra attuale comprensione di come la meccanica del citoscheletro e la dinamica del flusso del citosol sono accoppiate rimane poco compresa. Qui, un approccio di ricostituzione in vitro viene impiegato per caratterizzare le proprietà materiali dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello per il citoscheletro cellulare. La contrazione del gel è guidata dalla contrattilità motoria della miosina, che porta all’emergere di un flusso del solvente penetrante. Il documento descrive come preparare questi gel ed eseguire esperimenti. Discutiamo anche di come misurare e analizzare il flusso di solvente e la contrazione del gel sia su scala locale che globale. Vengono fornite le varie relazioni di scala utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse le sfide sperimentali e le insidie comuni, inclusa la loro rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.
Le cellule viventi hanno proprietà meccaniche uniche. Oltre alla capacità di reagire passivamente alle forze applicate, sono anche in grado di generare attivamente forze in risposta a stimoli esterni1. Queste caratteristiche, che sono essenziali per una varietà di processi cellulari, in particolare durante la motilità cellulare, sono principalmente attribuite alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori molecolari della miosina e proteine accessorie. Queste reti di actomiosina mostrano proprietà intrinseche di auto-organizzazione e contrazione guidate dalle proteine motorie della miosina, che reticolano i filamenti di actina e generano attivamente stress meccanici nella rete alimentata dall’idrolisi ATP2.
Numerosi studi sperimentali e teorici sono stati condotti per studiare le proprietà materiali del citoscheletro3. L’opinione comunemente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico4. Ciò significa che su brevi scale temporali, il citoscheletro si comporta come un materiale elastico e, su lunghe scale temporali, si comporta come un fluido viscoso a causa delle proteine reticolanti e del distacco motorio della miosina (e del riattaccamento), che consente alla rete di ruotare dinamicamente. In molte situazioni, tuttavia, il modello viscoelastico non può descrivere i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un quadro che descrive il citoscheletro e, più in generale, il citoplasma cellulare descritto come un materiale attivo poroelastico 5,6. Due caratteristiche principali caratterizzano questi tipi di materiali. (i) La prima caratteristica principale è la generazione di un flusso del citosol penetrante (il “solvente”) attraverso i pori del gel da gradienti di contrattilità guidati dai motori della miosina, che sono alla base di processi come il blebbing cellulare7, la motilità8 e le oscillazioni della forma cellulare9. L’emergere di tali flussi citosolici può essere locale, per il blebbing, o globale, come nella motilità cellulare. In quest’ultimo caso, le sollecitazioni contrattili applicate nella parte posteriore della cellula guidano il flusso del liquido citosolico verso il fronte cellulare, che reintegra il pool proteico necessario per l’assemblaggio dei lamellipodi8. (ii) La seconda caratteristica principale è che il rilassamento delle sollecitazioni è diffusivo ed è caratterizzato da una costante di diffusione efficace, che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità del gel e dalla viscosità del solvente5. La costante di diffusione poroelastica determina la velocità con cui il sistema risponde a una sollecitazione applicata. Costanti di diffusione più elevate corrispondono a una più rapida ridistribuzione dello stress. Questo, a sua volta, determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracellulare a essere ridistribuito all’interno della cellula a seguito di stress meccanico applicato, sia esterno che interno, come le sollecitazioni contrattili attive generate dai motori della miosina. Questi esempi, quindi, dimostrano che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati e non possono essere trattati separatamente3.
Poiché le cellule possono regolare le loro proprietà meccaniche in vari modi, l’interazione tra meccanica della rete e dinamica del flusso dei fluidi rimane poco compresa. Un potente approccio alternativo è quello di utilizzare sistemi ricostituiti in vitro che consentono il pieno controllo dei vari costituenti microscopici e dei parametri del sistema, il che rende questi sistemi modello ottimali per l’analisi fisica10,11. Questo approccio è stato impiegato con successo per studiare l’impatto della composizione proteica e della geometria del sistema sulla motilità basata sull’actina 12,13,14,15,16,17,18, il pattern 2D delle reti di actomiosina 19,20,21,22, e l’interazione tra contrattilità della rete e fluidodinamica dei gel di actomiosina poroelastici, che è al centro del presente articolo23.
In questo manoscritto, la preparazione di reti di actomiosina elastica contrattile di dimensioni controllabili e proprietà del materiale è discussa sulla base del lavoro di Ideses et al.23. Viene analizzata e quantificata la dinamica del gel contante e del solvente drenato, attraverso la quale viene dimostrato che questi gel di actomiosina possono essere descritti come un materiale attivo poroelastico. Lo studio dell’effetto della viscosità del solvente sulla diffusività dello stress conferma ulteriormente la natura poroelastica di queste reti. Vengono fornite le varie relazioni di ridimensionamento utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza dei risultati sperimentali per il citoscheletro cellulare.
Qui, un approccio in vitro è impiegato per caratterizzare la meccanica dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello del citoscheletro cellulare e, più di generale, del citoplasma cellulare, che ha dimostrato di comportarsi come un materiale poroelastico 3,5. La reologia del citoscheletro cellulare (citoplasma) è stata caratterizzata da una costante di diffusione poroelastica, che determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracel…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Dina Aranovich per la purificazione e l’etichettatura delle proteine. G.L. è grato al Ministero israeliano della Scienza, della Tecnologia e dello Spazio per la borsa di studio Jabotinsky PhD. A.B.G. è grata alla Israel Science Foundation (sovvenzione 2101/20) e al Ministero della Scienza e della Tecnologia – Stato di Israele (sovvenzione 3-17491) per il sostegno finanziario.
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
Oven | WTC Binder | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |