Summary

La meccanica delle reti di actiosina contrattile (poro-)elastica come sistema modello del citoscheletro cellulare

Published: March 10, 2023
doi:

Summary

In questo lavoro, un approccio di ricostituzione in vitro è impiegato per studiare la poroelasticità dei gel di actomiosina di condizioni controllate. Viene quantificata la dinamica del gel di actomiosina e del solvente incorporato, attraverso la quale viene dimostrata la poroelasticità della rete. Discutiamo anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.

Abstract

Le cellule possono cambiare attivamente le loro forme e diventare mobili, una proprietà che dipende dalla loro capacità di riorganizzare attivamente la loro struttura interna. Questa caratteristica è attribuita alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori di miosina e proteine accessorie che presentano proprietà di contrazione intrinseca. La visione solitamente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico. Tuttavia, questo modello non può sempre spiegare i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un’immagine che descrive il citoscheletro come un materiale attivo poroelastico, una rete elastica incorporata con citosol. I gradienti di contrattilità generati dai motori della miosina guidano il flusso del citosol attraverso i pori del gel, che deduce che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati. Una caratteristica principale della poroelasticità è il rilassamento diffusivo delle tensioni nella rete, caratterizzato da un’efficace costante di diffusione che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità e dalla viscosità del citosol (solvente). Poiché le cellule hanno molti modi per regolare la loro struttura e le proprietà dei materiali, la nostra attuale comprensione di come la meccanica del citoscheletro e la dinamica del flusso del citosol sono accoppiate rimane poco compresa. Qui, un approccio di ricostituzione in vitro viene impiegato per caratterizzare le proprietà materiali dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello per il citoscheletro cellulare. La contrazione del gel è guidata dalla contrattilità motoria della miosina, che porta all’emergere di un flusso del solvente penetrante. Il documento descrive come preparare questi gel ed eseguire esperimenti. Discutiamo anche di come misurare e analizzare il flusso di solvente e la contrazione del gel sia su scala locale che globale. Vengono fornite le varie relazioni di scala utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse le sfide sperimentali e le insidie comuni, inclusa la loro rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.

Introduction

Le cellule viventi hanno proprietà meccaniche uniche. Oltre alla capacità di reagire passivamente alle forze applicate, sono anche in grado di generare attivamente forze in risposta a stimoli esterni1. Queste caratteristiche, che sono essenziali per una varietà di processi cellulari, in particolare durante la motilità cellulare, sono principalmente attribuite alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori molecolari della miosina e proteine accessorie. Queste reti di actomiosina mostrano proprietà intrinseche di auto-organizzazione e contrazione guidate dalle proteine motorie della miosina, che reticolano i filamenti di actina e generano attivamente stress meccanici nella rete alimentata dall’idrolisi ATP2.

Numerosi studi sperimentali e teorici sono stati condotti per studiare le proprietà materiali del citoscheletro3. L’opinione comunemente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico4. Ciò significa che su brevi scale temporali, il citoscheletro si comporta come un materiale elastico e, su lunghe scale temporali, si comporta come un fluido viscoso a causa delle proteine reticolanti e del distacco motorio della miosina (e del riattaccamento), che consente alla rete di ruotare dinamicamente. In molte situazioni, tuttavia, il modello viscoelastico non può descrivere i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un quadro che descrive il citoscheletro e, più in generale, il citoplasma cellulare descritto come un materiale attivo poroelastico 5,6. Due caratteristiche principali caratterizzano questi tipi di materiali. (i) La prima caratteristica principale è la generazione di un flusso del citosol penetrante (il “solvente”) attraverso i pori del gel da gradienti di contrattilità guidati dai motori della miosina, che sono alla base di processi come il blebbing cellulare7, la motilità8 e le oscillazioni della forma cellulare9. L’emergere di tali flussi citosolici può essere locale, per il blebbing, o globale, come nella motilità cellulare. In quest’ultimo caso, le sollecitazioni contrattili applicate nella parte posteriore della cellula guidano il flusso del liquido citosolico verso il fronte cellulare, che reintegra il pool proteico necessario per l’assemblaggio dei lamellipodi8. (ii) La seconda caratteristica principale è che il rilassamento delle sollecitazioni è diffusivo ed è caratterizzato da una costante di diffusione efficace, che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità del gel e dalla viscosità del solvente5. La costante di diffusione poroelastica determina la velocità con cui il sistema risponde a una sollecitazione applicata. Costanti di diffusione più elevate corrispondono a una più rapida ridistribuzione dello stress. Questo, a sua volta, determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracellulare a essere ridistribuito all’interno della cellula a seguito di stress meccanico applicato, sia esterno che interno, come le sollecitazioni contrattili attive generate dai motori della miosina. Questi esempi, quindi, dimostrano che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati e non possono essere trattati separatamente3.

Poiché le cellule possono regolare le loro proprietà meccaniche in vari modi, l’interazione tra meccanica della rete e dinamica del flusso dei fluidi rimane poco compresa. Un potente approccio alternativo è quello di utilizzare sistemi ricostituiti in vitro che consentono il pieno controllo dei vari costituenti microscopici e dei parametri del sistema, il che rende questi sistemi modello ottimali per l’analisi fisica10,11. Questo approccio è stato impiegato con successo per studiare l’impatto della composizione proteica e della geometria del sistema sulla motilità basata sull’actina 12,13,14,15,16,17,18, il pattern 2D delle reti di actomiosina 19,20,21,22, e l’interazione tra contrattilità della rete e fluidodinamica dei gel di actomiosina poroelastici, che è al centro del presente articolo23.

In questo manoscritto, la preparazione di reti di actomiosina elastica contrattile di dimensioni controllabili e proprietà del materiale è discussa sulla base del lavoro di Ideses et al.23. Viene analizzata e quantificata la dinamica del gel contante e del solvente drenato, attraverso la quale viene dimostrato che questi gel di actomiosina possono essere descritti come un materiale attivo poroelastico. Lo studio dell’effetto della viscosità del solvente sulla diffusività dello stress conferma ulteriormente la natura poroelastica di queste reti. Vengono fornite le varie relazioni di ridimensionamento utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza dei risultati sperimentali per il citoscheletro cellulare.

Protocol

1. Trattamento superficiale del vetro e passivazione: NOTA: Questa sezione include tre fasi principali (vedere la Figura 1): (i) pulizia e idrofilizzazione, (ii) silanizzazione e (iii) passivazione superficiale. Pulizia e idrofilizzazioneUtilizzare la soluzione Piranha per la pulizia della superficie del vetro.NOTA: La soluzione di Piranha è una miscela di 30% H 2 O 2 e 70% H2SO4 (Tabella d…

Representative Results

Per esperimento vengono utilizzati due vetrini di vetro. I vetrini vengono puliti e passivati con polimeri PEG. La passivazione è essenziale per evitare che le proteine solubilizzate aderiscano alle superfici vetrate nelle prime fasi sperimentali e per minimizzare l’interazione della rete di contrazione con le pareti vetrate. L’incapacità di ottenere una buona passivazione può portare a una contrazione inefficiente e, in casi estremi, può persino inibire la formazione di reti di actina. <s…

Discussion

Qui, un approccio in vitro è impiegato per caratterizzare la meccanica dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello del citoscheletro cellulare e, più di generale, del citoplasma cellulare, che ha dimostrato di comportarsi come un materiale poroelastico 3,5. La reologia del citoscheletro cellulare (citoplasma) è stata caratterizzata da una costante di diffusione poroelastica, che determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracel…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Dina Aranovich per la purificazione e l’etichettatura delle proteine. G.L. è grato al Ministero israeliano della Scienza, della Tecnologia e dello Spazio per la borsa di studio Jabotinsky PhD. A.B.G. è grata alla Israel Science Foundation (sovvenzione 2101/20) e al Ministero della Scienza e della Tecnologia – Stato di Israele (sovvenzione 3-17491) per il sostegno finanziario.

Materials

(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich Company 175617 Stored under Argon atmosphere at 4 °C 
Acetic acid Bio-Lab ltd 1070521
Alexa-Fluor 488 Invitrogene A10254 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
Alexa-Fluor 647 Invitrogene A20347 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
BSA Sigma -Aldrich Company A3059 Stored at 4 °C 
Catalase Sigma -Aldrich Company C9322 The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips Mezel-glaser CG2222-1.5 Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase Roche Life Science Products 10736988001 Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate Roche Life Science Products 10621714001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT Roche Life Science Products 10708984001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System  Photometrics DV2-CUBE
EGTA MP Biomedicals 195174
EM-CCD Camera Andor Technology Ltd DV 887
EM-CCD Camera Photometrics Evolve Delta
Ethanol Bio-Lab ltd 525050300
Flourescence Lamp Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres Polysciences 17151-10 200 nm diameter
Glucose ICN Biomedicals Inc 194024 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase Sigma-Aldrich Company G7141 Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol ICN Biomedicals Inc 800687
Glycine MP Biomedicals 808822
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich Company 216763 Stored at 4 °C 
KCl EMD Millipore Corp. 529552
Methanol Bio-Lab ltd 1368052100
MgCl2 EMD Millipore Corp. 442615
Microscope Leica Microsystems DMI3000
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-5k  Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres Spherotech FP-2056-2  2300 nm diameter
Objective (10x) Leica Germany HC PL AP0 UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x) Leica Germany 506304  Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven WTC Binder
Parafilm Amcor PM-996
PBS Buffer Sigma-Aldrich Company P4417
Shutter Driver Vincet Associates VMM D1
Silica gel Merck 1.01907.5000
Sonicator Elma Elmasonic P
Sulfuric acid Carlo Erba reagents 410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System Photometrics
TRIS MP Biomedicals 819620
UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E Gilson FD10001 1–10 uL
MATLAB R2017b MathWorks Data quantification 
MetaMorph  Molecular devices Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)

Riferimenti

  1. Alberts, B., et al. . Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).
  2. Howard, J. . Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -. S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Choudhary, S., Livne, G., Gat, S., Bernheim-Groswasser, A. The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (193), e64377, doi:10.3791/64377 (2023).

View Video