Summary

Valutazione dell'efficacia dei perossiacidi organici per l'eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando un approccio che combina metodi statici e dinamici

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Questo protocollo descrive un approccio che combina metodi statici e dinamici per valutare l’efficacia dei perossiacidi organici per l’eradicazione dei biofilm nell’industria lattiero-casearia. Questo approccio può anche essere utilizzato per testare l’efficacia di nuove formulazioni biologiche o chimiche per il controllo dei biofilm.

Abstract

La presenza di biofilm nell’industria lattiero-casearia è fonte di grande preoccupazione, in quanto possono portare alla produzione di prodotti lattiero-caseari non sicuri e alterati a causa della loro elevata resistenza alla maggior parte delle procedure CIP (clean-in-place) frequentemente utilizzate negli impianti di lavorazione. Pertanto, è imperativo sviluppare nuove strategie di controllo del biofilm per l’industria lattiero-casearia. Questo protocollo ha lo scopo di valutare l’efficacia dei perossiacidi organici (acidi peracetico, perpropionico e perlattico e un disinfettante commerciale a base di acido peracetico) per l’eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando una combinazione di metodi statici e dinamici. Tutti i disinfettanti sono stati testati sui batteri produttori di biofilm più forti in un biofilm singolo o misto utilizzando il test MBEC (minimum biofilm eradication concentration), un metodo di screening statico ad alto rendimento. Un tempo di contatto di 5 minuti con i disinfettanti alle concentrazioni raccomandate ha eliminato con successo sia il biofilm singolo che quello misto. Sono attualmente in corso studi per confermare queste osservazioni utilizzando il reattore biofilm del Center for Disease Control (CDC), un metodo dinamico per imitare le condizioni in situ . Questo tipo di bioreattore consente l’uso di una superficie in acciaio inossidabile, che costituisce la maggior parte delle attrezzature e delle superfici industriali. I risultati preliminari del reattore sembrano confermare l’efficacia dei perossiacidi organici contro i biofilm. L’approccio combinato descritto in questo studio può essere utilizzato per sviluppare e testare nuove formulazioni biologiche o chimiche per il controllo dei biofilm e l’eradicazione dei microrganismi.

Introduction

L’industria lattiero-casearia è un importante settore industriale in tutto il mondo, anche in Canada, dove ci sono più di 10.500 aziende lattiero-casearie che producono quasi 90 milioni di hl di latte ogni anno1. Nonostante i severi requisiti igienici imposti nell’industria lattiero-casearia, compresi gli impianti di trasformazione, il latte costituisce un ottimo terreno di coltura per i microrganismi e, pertanto, è probabile che i prodotti lattiero-caseari contengano microrganismi, inclusi microrganismi patogeni o deterioranti. Questi agenti patogeni possono causare varie malattie; ad esempio, Salmonella sp. e Listeria monocytogenes possono causare gastroenterite e meningite, rispettivamente2. I microrganismi di deterioramento possono influenzare la qualità e le proprietà organolettiche dei prodotti lattiero-caseari producendo gas, enzimi extracellulari o acidi3. Anche l’aspetto e il colore del latte possono essere alterati, ad esempio da Pseudomonas spp.4.

Alcuni di questi microrganismi possono formare biofilm su diverse superfici, incluso l’acciaio inossidabile. Tali biofilm consentono la persistenza e la moltiplicazione dei microrganismi sulla superficie dell’apparecchiatura e, quindi, la contaminazione dei prodotti lattiero-caseari5. I biofilm sono problematici anche a causa della loro capacità di impedire il trasferimento di calore e accelerare la corrosione delle apparecchiature, portando alla sostituzione prematura dell’apparecchiatura e, quindi, a perdite economiche6.

Le procedure CIP (clean-in-place) consentono all’industria alimentare di controllare la crescita dei microrganismi. Queste procedure prevedono l’uso sequenziale di idrossido di sodio, acido nitrico e, talvolta, disinfettanti contenenti acido ipocloroso e acido peracetico 7,8. Sebbene l’acido ipocloroso sia altamente efficace contro i microrganismi, reagisce anche con la materia organica naturale, causando la formazione di sottoprodotti tossici9. L’acido peracetico non genera sottoprodotti nocivi10; Tuttavia, la sua efficacia contro i biofilm nell’industria alimentare è molto variabile10,11. Recentemente, altri perossiacidi, tra cui gli acidi perpropionici e perlattici, sono stati studiati per la loro attività antimicrobica, e sembrano essere una buona alternativa per il controllo della crescita microbica nei biofilm12,13.

Pertanto, questo studio mirava a valutare l’efficacia dei perossiacidi organici (acido peracetico, perpropionico e perlattico e un disinfettante a base di acido peracetico) per l’eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando un approccio che combina il saggio MBEC (minimum biofilm eradication concentration), un metodo di screening statico ad alta produttività e il reattore biofilm del Center for Disease Control (CDC), un metodo dinamico che imita in situ . Condizioni. Il test MBEC è di seguito denominato “piastre di microtitolazione a biofilm” nel protocollo. Il protocollo qui presentato e i risultati rappresentativi dimostrano l’efficacia dei perossiacidi organici e la loro potenziale applicazione per il controllo dei biofilm microbici nell’industria lattiero-casearia.

Protocol

Il lavoro contenuto in questo articolo richiede un laboratorio di livello di biosicurezza 2 ed è stato precedentemente approvato (numero di progetto 119689) dal comitato istituzionale di biosicurezza dell’Université Laval. NOTA: Il diagramma di flusso nella Figura 1 rappresenta una sintesi della metodologia che combina approcci statici e dinamici utilizzata per valutare l’efficacia dei perossiacidi organici per l’eradicazione dei biofilm. <p class="jove_titl…

Representative Results

L’analisi SEM mostra la presenza di biofilm prodotti da P. azotoformans PFl1A sui picchetti della micropiastra del biofilm (Figura 2A). Si può osservare una struttura tridimensionale del biofilm. Il P. azotoformans PFl1A è stato precedentemente identificato come un forte produttore di biofilm (A570 > 1.5) utilizzando piastre di microtitolazione a 96 pozzetti12. Inoltre, il biofilm PFl1A di P. azotoformans<…

Discussion

Il test MBEC (biofilm microplate assay) è stato il primo metodo ad essere riconosciuto come test standard di eradicazione del biofilm dall’ASTM17. Il nostro studio e altri hanno dimostrato che ci sono due passaggi critici quando si utilizza questo test: la fase di sonicazione (tempo e potenza) e il tempo di trattamento disinfettante18. Stewart e Parker hanno anche suggerito altri parametri che potrebbero influenzare l’esito del test, come la specie microbica, l’età del bi…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta dal Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc e dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Ringraziamo Teresa Paniconi per la critica recensione del manoscritto.

Materials

0.2 µm filters  Corning 09-754-28 diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 stainless-steel disc coupon Biosurface Technologies Corporation RD128-316
316 stainless-steel slide coupon Biosurface Technologies Corporation CBR 2128-316
96-microtiter plate Corning 07-200-89 cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate 
Acetic acid Sigma Aldrich 27225 store at RT
Aluminium stubs Electron Microscopy Science 75830-10 32x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% Electron Microscopy Sciences 16220 store at -20 °C
AB204-S/FACT Analytical balance Mettler Toledo AB204-S
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) Biosurface Technologies Corporation BST 02915
BioDestroy Groupe Sani Marc 09-10215 commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT
Carboy LDPE 20 L Cole Parmer 06031-52
CDC biofilm reactor Biosurface Technologies Corporation CRB 90 bioreactor
Cerium (IV) sulphate Thermo Scientific 35650-K2 store at RT
Confocal laser scanning microscope  LSM 700 Zeiss LSM 700
Dey-Engley neutralizing broth Millipore D3435-500G store at 4 °C
EMS950x + 350s gold sputter  Electron Microscopy Sciences
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14121 with BDMA
Ethyl alcohol 95%, USP Greenfield global P016EA95 store at RT
Ferroin indicator solution Sigma Aldrich 318922-100ML store at RT
Filling/venting cap Cole Parmer RK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316 fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C
Glass flow break Biosurface Technologies Corporation FB 50
Gold with silver paint  Electron Microscopy Sciences 12684-15
Heating plate set Biosurface Technologies Corporation 110V Stir Plate
Hex screwdriver Biosurface Technologies Corporation CBR 5497
Hydrogen peroxide Sigma 216763 store at 4 °C
Inoculating loops VWR 12000-812 sterile, 10 µl
Lactic acid Laboratoire MAT LU-0200 store at RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head Cole Parmer 77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base Innovotech 19111 Biofilm microtiter plate
Oxford agar base Thermo Scientific OXCM0856B store at 4 °C
Plastic coupon holder Biosurface Technologies Corporation CBR 2203
Plastic slide holder rod Biosurface Technologies Corporation CBR 2203-GL
Potassium iodide Fisher Chemical P410-500 store at RT
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) Wiha 26015
Propionic acid Laboratoire MAT PF-0221 store at RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance Cole Parmer  UZ-11976-3
Scanning electron microscope JSM-6360LV model JEOL JSM-6360LV SEM and user control interface
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.205 (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Screw cap tube, 50 mL Sarstedt 62.547.205 (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences  12300 store at -20 °C
Sodium thiosulfate Thermo Scientific AC124270010 store at RT
Sonication bath Fisher 15-336-122 5,7 L
Starch solution Anachemia AC8615 store at RT
Sulfuric acid Sigma Aldrich 258105-500ML store at RT
Tryptic soy agar BD Bacto DF0369-17-6 store at RT
Tryptic soy broth BD Bacto DF0370-17-3 store at RT
Tubing Masterflex L/S 16 25' Cole Parmer MFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25' Cole Parmer MFX0642418
Tygon SPT-3350 silicon tubing  Saint-Gobain ABW18NSF IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
Vortex Cole Palmer UZ-04724-00
Water bath  VWR 89202-970
Zen software Zeiss

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, E., Jean, J. Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods. J. Vis. Exp. (190), e64619, doi:10.3791/64619 (2022).

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