Questo protocollo descrive un approccio che combina metodi statici e dinamici per valutare l’efficacia dei perossiacidi organici per l’eradicazione dei biofilm nell’industria lattiero-casearia. Questo approccio può anche essere utilizzato per testare l’efficacia di nuove formulazioni biologiche o chimiche per il controllo dei biofilm.
La presenza di biofilm nell’industria lattiero-casearia è fonte di grande preoccupazione, in quanto possono portare alla produzione di prodotti lattiero-caseari non sicuri e alterati a causa della loro elevata resistenza alla maggior parte delle procedure CIP (clean-in-place) frequentemente utilizzate negli impianti di lavorazione. Pertanto, è imperativo sviluppare nuove strategie di controllo del biofilm per l’industria lattiero-casearia. Questo protocollo ha lo scopo di valutare l’efficacia dei perossiacidi organici (acidi peracetico, perpropionico e perlattico e un disinfettante commerciale a base di acido peracetico) per l’eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando una combinazione di metodi statici e dinamici. Tutti i disinfettanti sono stati testati sui batteri produttori di biofilm più forti in un biofilm singolo o misto utilizzando il test MBEC (minimum biofilm eradication concentration), un metodo di screening statico ad alto rendimento. Un tempo di contatto di 5 minuti con i disinfettanti alle concentrazioni raccomandate ha eliminato con successo sia il biofilm singolo che quello misto. Sono attualmente in corso studi per confermare queste osservazioni utilizzando il reattore biofilm del Center for Disease Control (CDC), un metodo dinamico per imitare le condizioni in situ . Questo tipo di bioreattore consente l’uso di una superficie in acciaio inossidabile, che costituisce la maggior parte delle attrezzature e delle superfici industriali. I risultati preliminari del reattore sembrano confermare l’efficacia dei perossiacidi organici contro i biofilm. L’approccio combinato descritto in questo studio può essere utilizzato per sviluppare e testare nuove formulazioni biologiche o chimiche per il controllo dei biofilm e l’eradicazione dei microrganismi.
L’industria lattiero-casearia è un importante settore industriale in tutto il mondo, anche in Canada, dove ci sono più di 10.500 aziende lattiero-casearie che producono quasi 90 milioni di hl di latte ogni anno1. Nonostante i severi requisiti igienici imposti nell’industria lattiero-casearia, compresi gli impianti di trasformazione, il latte costituisce un ottimo terreno di coltura per i microrganismi e, pertanto, è probabile che i prodotti lattiero-caseari contengano microrganismi, inclusi microrganismi patogeni o deterioranti. Questi agenti patogeni possono causare varie malattie; ad esempio, Salmonella sp. e Listeria monocytogenes possono causare gastroenterite e meningite, rispettivamente2. I microrganismi di deterioramento possono influenzare la qualità e le proprietà organolettiche dei prodotti lattiero-caseari producendo gas, enzimi extracellulari o acidi3. Anche l’aspetto e il colore del latte possono essere alterati, ad esempio da Pseudomonas spp.4.
Alcuni di questi microrganismi possono formare biofilm su diverse superfici, incluso l’acciaio inossidabile. Tali biofilm consentono la persistenza e la moltiplicazione dei microrganismi sulla superficie dell’apparecchiatura e, quindi, la contaminazione dei prodotti lattiero-caseari5. I biofilm sono problematici anche a causa della loro capacità di impedire il trasferimento di calore e accelerare la corrosione delle apparecchiature, portando alla sostituzione prematura dell’apparecchiatura e, quindi, a perdite economiche6.
Le procedure CIP (clean-in-place) consentono all’industria alimentare di controllare la crescita dei microrganismi. Queste procedure prevedono l’uso sequenziale di idrossido di sodio, acido nitrico e, talvolta, disinfettanti contenenti acido ipocloroso e acido peracetico 7,8. Sebbene l’acido ipocloroso sia altamente efficace contro i microrganismi, reagisce anche con la materia organica naturale, causando la formazione di sottoprodotti tossici9. L’acido peracetico non genera sottoprodotti nocivi10; Tuttavia, la sua efficacia contro i biofilm nell’industria alimentare è molto variabile10,11. Recentemente, altri perossiacidi, tra cui gli acidi perpropionici e perlattici, sono stati studiati per la loro attività antimicrobica, e sembrano essere una buona alternativa per il controllo della crescita microbica nei biofilm12,13.
Pertanto, questo studio mirava a valutare l’efficacia dei perossiacidi organici (acido peracetico, perpropionico e perlattico e un disinfettante a base di acido peracetico) per l’eradicazione dei biofilm lattiero-caseari utilizzando un approccio che combina il saggio MBEC (minimum biofilm eradication concentration), un metodo di screening statico ad alta produttività e il reattore biofilm del Center for Disease Control (CDC), un metodo dinamico che imita in situ . Condizioni. Il test MBEC è di seguito denominato “piastre di microtitolazione a biofilm” nel protocollo. Il protocollo qui presentato e i risultati rappresentativi dimostrano l’efficacia dei perossiacidi organici e la loro potenziale applicazione per il controllo dei biofilm microbici nell’industria lattiero-casearia.
Il test MBEC (biofilm microplate assay) è stato il primo metodo ad essere riconosciuto come test standard di eradicazione del biofilm dall’ASTM17. Il nostro studio e altri hanno dimostrato che ci sono due passaggi critici quando si utilizza questo test: la fase di sonicazione (tempo e potenza) e il tempo di trattamento disinfettante18. Stewart e Parker hanno anche suggerito altri parametri che potrebbero influenzare l’esito del test, come la specie microbica, l’età del bi…
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dal Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc e dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Ringraziamo Teresa Paniconi per la critica recensione del manoscritto.
0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
Water bath | VWR | 89202-970 | |
Zen software | Zeiss |