Introduciamo quattro metodi per valutare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate utilizzando tecniche in vitro . Questi metodi possono essere adattati per studiare le interazioni di diverse nanoparticelle e superfici nanostrutturate con una vasta gamma di specie microbiche.
Le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate, come argento, ossido di zinco, biossido di titanio e ossido di magnesio, sono state esplorate in precedenza in contesti clinici e ambientali e in prodotti alimentari di consumo. Tuttavia, la mancanza di coerenza nei metodi sperimentali e nei materiali utilizzati è culminata in risultati contrastanti, anche tra studi sugli stessi tipi di nanostrutture e specie batteriche. Per i ricercatori che desiderano impiegare nanostrutture come additivo o rivestimento nella progettazione di un prodotto, questi dati contrastanti limitano il loro utilizzo in contesti clinici.
Per affrontare questo dilemma, in questo articolo, presentiamo quattro diversi metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate e discutiamo la loro applicabilità in diversi scenari. L’adattamento di metodi coerenti dovrebbe portare a dati riproducibili che possono essere confrontati tra gli studi e implementati per diversi tipi di nanostrutture e specie microbiche. Introduciamo due metodi per determinare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle e due metodi per le attività antimicrobiche delle superfici nanostrutturate.
Per le nanoparticelle, il metodo della cocoltura diretta può essere utilizzato per determinare le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime di nanoparticelle e il metodo di coltura a esposizione diretta può essere utilizzato per valutare in tempo reale l’attività batteriostatica rispetto all’attività battericida derivante dall’esposizione alle nanoparticelle. Per le superfici nanostrutturate, il metodo della coltura diretta viene utilizzato per determinare la vitalità dei batteri indirettamente e direttamente a contatto con superfici nanostrutturate e il metodo di esposizione a contatto focalizzato viene utilizzato per esaminare l’attività antimicrobica su un’area specifica di una superficie nanostrutturata. Discutiamo le principali variabili sperimentali da considerare per la progettazione di studi in vitro quando si determinano le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle e delle superfici nanostrutturate. Tutti questi metodi sono relativamente a basso costo, impiegano tecniche relativamente facili da padroneggiare e ripetibili per coerenza e sono applicabili a una vasta gamma di tipi di nanostrutture e specie microbiche.
Solo negli Stati Uniti, 1,7 milioni di individui sviluppano un’infezione acquisita in ospedale (HAI) ogni anno, con una su 17 di queste infezioni con conseguente morte1. Inoltre, si stima che i costi di trattamento per le IAA vadano da $ 28 miliardi a $ 45 miliardi all’anno 1,2. Queste ICA sono predominate da Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA)3,4 e Pseudomonas aeruginosa4, che sono comunemente isolati dalle infezioni croniche della ferita e di solito richiedono un trattamento esteso e tempo per produrre un esito favorevole al paziente.
Negli ultimi decenni, sono state sviluppate più classi di antibiotici per trattare le infezioni legate a questi e ad altri batteri patogeni. Ad esempio, analoghi della rifamicina sono stati usati per trattare MRSA, altre infezioni gram-positive e gram-negative e infezioni da Mycobacterium spp.5. Nel 1990, per trattare efficacemente un numero crescente di infezioni da M. tuberculosis, ulteriori farmaci sono stati combinati con analoghi della rifamicina per aumentare la loro efficacia. Tuttavia, circa il 5% dei casi di M. tuberculosis rimane resistente allarifampicina 5,6 e vi è una crescente preoccupazione per quanto riguarda i batteri multi-farmaco resistenti7. Attualmente, l’uso di antibiotici da solo potrebbe non essere sufficiente nel trattamento delle IAA e ciò ha provocato una continua ricerca di terapie antimicrobiche alternative1.
I metalli pesanti, come l’argento (Ag)8,9,10 e l’oro (Au)11, e la ceramica, come il biossido di titanio (TiO 2)12 e l’ossido di zinco (ZnO)13, in forma di nanoparticelle (NP) (AgNP, AuNP, TiO 2 NPe ZnONP, rispettivamente) sono stati esaminati per le loro attività antimicrobiche e sono stati identificati come potenziali alternative antibiotiche. Inoltre, materiali bioriassorbibili, come leghe di magnesio (leghe di Mg)14,15,16, nanoparticelle di ossido di magnesio 17,18,19,20,21 e nanoparticelle di idrossido di magnesio [nMgO e nMg(OH)2, rispettivamente]22,23,24, sono stati esaminati anche. Tuttavia, i precedenti studi antimicrobici sulle nanoparticelle hanno utilizzato materiali e metodi di ricerca incoerenti, ottenendo dati difficili o impossibili da confrontare e talvolta contraddittori in natura18,19. Ad esempio, la concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione battericida minima (MBC) di nanoparticelle d’argento variavano significativamente in diversi studi. Ipe et al.25 hanno valutato le attività antibatteriche degli AgNP con una dimensione media delle particelle di ~ 26 nm per determinare le MIC contro batteri gram-positivi e gram-negativi. Le MIC identificate per P. aeruginosa, E. coli, S. aureus e MRSA erano rispettivamente 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 10 μg/mL. Al contrario, Parvekar et al.26 hanno valutato AgNP con una dimensione media delle particelle di 5 nm. In questo caso, l’AgNP MIC e un MBC di 0,625 mg/ml sono risultati efficaci contro S. aureus. Inoltre, Loo et al.27 hanno valutato AgNP con una dimensione di 4,06 nm. Quando E. coli è stato esposto a queste nanoparticelle, il MIC e l’MBC sono stati riportati a 7,8 μg / ml. Infine, Ali et al.28 hanno studiato le proprietà antibatteriche degli AgNP sferici con una dimensione media di 18 nm. Quando P. aeruginosa, E. coli e MRSA sono stati esposti a queste nanoparticelle, il MIC è stato identificato a 27 μg / mL, 36 μg / mL, 27 μg / mL e 36 μg / mL, rispettivamente, e l’MBC è stato identificato a 36 μg / mL, 42 μg / mL e 30 μg / mL, rispettivamente.
Sebbene l’attività antibatterica delle nanoparticelle sia stata ampiamente studiata e riportata negli ultimi decenni, non esiste uno standard per i materiali e i metodi di ricerca utilizzati per consentire confronti diretti tra gli studi. Per questo motivo, presentiamo due metodi, il metodo di co-coltura diretta (metodo A) e il metodo di esposizione diretta (metodo B), per caratterizzare e confrontare le attività antimicrobiche delle nanoparticelle mantenendo i materiali e i metodi coerenti.
Oltre alle nanoparticelle, sono state esaminate anche superfici nanostrutturate per attività antibatteriche. Questi includono materiali a base di carbonio, come nanofogli di grafene, nanotubi di carbonio e grafite29, nonché leghe pure di Mg e Mg. Ognuno di questi materiali ha mostrato almeno un meccanismo antibatterico, tra cui danni fisici imposti alle membrane cellulari da materiali a base di carbonio e danni ai processi metabolici o al DNA attraverso il rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS) quando il Mg si degrada. Inoltre, quando lo zinco (Zn) e il calcio (Ca) sono combinati nella formazione di leghe di Mg, viene migliorata la raffinatezza della granulometria della matrice di Mg, il che porta ad una riduzione dell’adesione batterica alle superfici del substrato rispetto ai campioni di solo Mg14. Per dimostrare l’attività antibatterica, presentiamo il metodo della coltura diretta (metodo C), che determina l’adesione batterica su e intorno a materiali nanostrutturati nel tempo attraverso la quantificazione di unità formanti colonie batteriche (CFU) con contatto superficiale diretto e indiretto.
La geometria delle nanostrutture sulle superfici, comprese le dimensioni, la forma e l’orientamento, potrebbe influenzare le attività battericide dei materiali. Ad esempio, Lin et al.16 hanno fabbricato diversi strati nanostrutturati di MgO sulle superfici dei substrati di Mg attraverso l’anodizzazione e la deposizione elettroforetica (EPD). Dopo un periodo di esposizione alla superficie nanostrutturata in vitro, la crescita di S. aureus è risultata sostanzialmente ridotta rispetto al Mg non trattato. Ciò ha indicato una maggiore potenza della superficie nanostrutturata contro l’adesione batterica rispetto alla superficie metallica Mg non trattata. Per rivelare i diversi meccanismi delle proprietà antibatteriche di varie superfici nanostrutturate, in questo articolo viene discusso un metodo di esposizione a contatto focalizzato (metodo D) che determina le interazioni cellula-superficie all’interno dell’area di interesse.
L’obiettivo di questo articolo è presentare quattro metodi in vitro applicabili a diverse nanoparticelle, superfici nanostrutturate e specie microbiche. Discutiamo le considerazioni chiave per ciascun metodo per produrre dati coerenti e riproducibili per la comparabilità. In particolare, il metodo di cocoltura diretta17 e il metodo dell’esposizione diretta sono utilizzati per esaminare le proprietà antimicrobiche delle nanoparticelle. Attraverso il metodo della co-coltura diretta, le concentrazioni minime inibitorie e battericide minime (MIC e MBC90-99,99, rispettivamente) possono essere determinate per le singole specie e la concentrazione più potente (MPC) può essere determinata per più specie. Attraverso il metodo dell’esposizione diretta, gli effetti batteriostatici o battericidi delle nanoparticelle a concentrazioni minime inibitorie possono essere caratterizzati da letture della densità ottica in tempo reale nel tempo. Il metodo della coltura diretta14 è adatto per esaminare i batteri direttamente e indirettamente a contatto con superfici nanostrutturate. Infine, viene presentato il metodo dell’esposizione a contatto focalizzato16 per esaminare l’attività antibatterica di un’area specifica su una superficie nanostrutturata attraverso l’applicazione diretta di batteri e la caratterizzazione della crescita batterica all’interfaccia cellula-nanostruttura. Questo metodo è modificato dallo standard industriale giapponese JIS Z 2801:200016 e ha lo scopo di concentrarsi sulle interazioni microbo-superficie ed escludere gli effetti della degradazione del campione di massa in coltura microbica sulle attività antimicrobiche.
Abbiamo presentato quattro metodi in vitro (A-D) per caratterizzare le attività antibatteriche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate. Mentre ciascuno di questi metodi quantifica la crescita batterica e la vitalità nel tempo in risposta ai nanomateriali, esistono alcune variazioni nei metodi utilizzati per misurare la densità iniziale di semina batterica, la crescita e la vitalità nel tempo. Tre di questi metodi, il metodo della cocoltura diretta (A)17, il metodo della coltura …
The authors have nothing to disclose.
Gli autori apprezzano il sostegno finanziario della National Science Foundation degli Stati Uniti (NSF CBET award 1512764 e NSF PIRE 1545852), del National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), della University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, del Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) e dell’UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant assegnato a Patricia Holt-Torres. Gli autori apprezzano l’assistenza fornita dalla Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) della UC-Riverside per l’uso di SEM / EDS e dal Dr. Perry Cheung per l’uso di XRD. Gli autori desiderano anche ringraziare Morgan Elizabeth Nator e Samhitha Tumkur per la loro assistenza con gli esperimenti e le analisi dei dati. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation o del National Institutes of Health.
1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
pH meter | VWR | SP70P | |
Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
Sonicator | VWR | 97043-936 | |
Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |