Summary

Imaging micro-CT e analisi morfometrica del cervello neonatale del topo

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Questo studio descrive i passaggi per ottenere immagini ad alta risoluzione del cervello di topo neonatale combinando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT) e un agente di contrasto in campioni ex vivo . Descriviamo le analisi morfometriche di base per quantificare le dimensioni e la forma del cervello in queste immagini.

Abstract

Le neuroimmagini sono uno strumento prezioso per studiare la morfologia del cervello in esperimenti che utilizzano modelli animali. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è diventata il metodo standard per i tessuti molli, anche se la sua bassa risoluzione spaziale pone alcuni limiti per i piccoli animali. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere informazioni tridimensionali (3D) ad alta risoluzione su cervelli e crani di topi neonati utilizzando la micro-tomografia computerizzata (micro-CT). Il protocollo include quei passaggi necessari per sezionare i campioni, colorare e scansionare il cervello e ottenere misurazioni morfometriche dell’intero organo e delle regioni di interesse (ROI). L’analisi delle immagini include la segmentazione delle strutture e la digitalizzazione delle coordinate dei punti. In sintesi, questo lavoro dimostra che la combinazione di micro-CT e soluzione di Lugol come agente di contrasto è un’alternativa adatta per l’imaging del cervello perinatale di piccoli animali. Questo flusso di lavoro di imaging ha applicazioni nella biologia dello sviluppo, nella biomedicina e in altre scienze interessate a valutare l’effetto di diversi fattori genetici e ambientali sullo sviluppo del cervello.

Introduction

L’imaging con tomografia microcomputerizzata (micro-CT) è uno strumento prezioso per diversi campi di ricerca. In biologia, è particolarmente adatto per la ricerca sulle ossa a causa dell’assorbimento dei raggi X nei tessuti mineralizzati. A causa di questa caratteristica, diverse questioni riguardanti lo sviluppo osseo1, il metabolismo2 e l’evoluzione 3,4, tra gli altri argomenti, sono state affrontate con l’assistenza della micro-TC. Nel 2008, de Crespigny et al.5 hanno dimostrato che le immagini micro-CT di cervelli adulti di topi e conigli potevano essere ottenute utilizzando lo iodio come agente di contrasto. Questo lavoro ha aperto una nuova applicazione per questa tecnica di imaging, poiché lo iodio ha permesso l’acquisizione di immagini da tessuti molli che altrimenti sarebbero stati insensibili ai raggi X. Pertanto, l’obiettivo generale della combinazione di micro-TC e di un mezzo di contrasto a base di iodio è quello di ottenere immagini ad alta risoluzione, in cui i tessuti molli possano essere distinti e identificati a livello meso o macro anatomico.

Questa tecnica ha un notevole potenziale per studi che richiedono una dettagliata caratterizzazione fenotipica ex vivo di piccoli campioni, come gli embrioni di topo, che sono ampiamente utilizzati nei disegni sperimentali6. Il mezzo di contrasto con iodio in combinazione con l’imaging micro-CT è stato utilizzato per ottenere quantificazioni volumetriche degli organi7 e delle strutture tridimensionali (3D)di riferimento 8,9. Negli ultimi anni, la scansione micro-CT di campioni colorati è stata applicata per descrivere le caratteristiche fenotipiche cerebrali dei roditori10 e sono stati proposti diversi miglioramenti alla tecnica. Per i cervelli adulti, un protocollo di 48 ore di immersione nello iodio, con una precedente fase di perfusione con un idrogel, è risultato produrre immagini di alta qualità11. Gignac et al.12 hanno ampliato i limiti di questa tecnica dimostrando che i cervelli di ratto colorati con iodio potevano essere processati per eseguire tecniche istologiche di routine. Allo stesso modo, queste procedure dimostrano risultati promettenti per i cervelli di roditori embrionali e pre-svezzamento 8,13,14,15.

Sebbene le neuroscienze abbiano ampiamente applicato tecniche basate sul microscopio per valutare diversi aspetti strutturali e funzionali dello sviluppo del cervello, tali studi sono più adatti per caratterizzare specifiche popolazioni cellulari o strutture spazialmente limitate. Al contrario, l’imaging micro-CT consente la descrizione di intere strutture e l’acquisizione di modelli 3D che conservano informazioni spaziali rilevanti, complementari alle tecniche microscopiche. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è anche una tecnica standard applicata per esplorare le caratteristiche strutturali dei piccoli animali 16,17,18. Tuttavia, la micro-CT, con l’uso di un mezzo di contrasto, presenta due vantaggi principali per i campioni fissi ex vivo: gli scanner micro-CT sono in gran parte meno costosi e facili da usare, e consentono una risoluzione spaziale più elevata rispetto alla MRI12.

Questo lavoro ha lo scopo di descrivere la procedura per ottenere immagini ad alta risoluzione dal cervello di topo neonatale utilizzando la scansione micro-CT dopo la colorazione con la soluzione di Lugol, un agente di contrasto a base di iodio. Viene presentato un protocollo completo, che inizia con le fasi preliminari come la raccolta del campione e la fissazione dei tessuti, e passa attraverso la colorazione, l’acquisizione di immagini micro-CT e l’elaborazione standard. L’elaborazione delle immagini include la segmentazione di un volume 3D dell’intera testa, così come del cervello, e la selezione di piani anatomici specifici per digitalizzare le coordinate dei punti che potrebbero poi essere utilizzate nelle analisi morfometriche. Sebbene l’attenzione si concentri sul cervello neonatale del topo, strategie simili possono essere applicate ad altri tessuti molli. Pertanto, il protocollo qui presentato è abbastanza flessibile da poter essere applicato, con lievi modifiche, ad altri tipi di campioni.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali hanno seguito le linee guida del Canadian Council on Animal Care. 1. Raccolta e preparazione dei campioni Preparare 500 ml di paraformaldeide (PFA) al 4%.Sotto un flusso di estrazione in un armadio, aggiungere 20 g di polvere di PFA a 250 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un becher di vetro da 1 L. Posizionare il becher con un magnete su una piastra magnetica per mescolare. Mescolare mentre si ris…

Representative Results

Qui viene presentato un protocollo di base per ottenere immagini ad alta risoluzione del cervello di topo neonatale. Le teste sono state scansionate dopo l’immersione nella soluzione di Lugol. Nonostante le loro piccole dimensioni, è possibile distinguere le principali strutture anatomiche cerebrali, come i bulbi olfattivi, la corteccia, il mesencefalo, il cervelletto e il rombencefalo (Figura 1). Diverse analisi possono essere eseguite utilizzando queste immagin…

Discussion

In questo lavoro, viene introdotto un protocollo conciso per la scansione dei tessuti cerebrali neonatali di topi utilizzando la micro-TC con un agente di contrasto. Inoltre, include procedure semplici per ottenere risultati quantitativi e qualitativi. Sulla base di questi metodi, è possibile eseguire ulteriori analisi alternative o complementari.

Come mostrato nel protocollo, le immagini micro-CT possono essere analizzate in diversi modi. In studi precedenti, il nostro gruppo ha stimato la v…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Wei Liu per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è finanziato da ANPCyT PICT 2017-2497 e PICT 2018-4113.

Materials

 µCT 35 Scanco Medical AG Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45 
Avizo Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes Daigger CH-CI4610-1856
Flux cabinet Esco AC2-458 
Glass beaker  Glassco GL-229.202.10
Glass bottle Simax CFB017
Glass funnel HDA VI1108
HCl Carlo Erba 403872 Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2 Cicarelli 804211 When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI Cicarelli PA131542.1210 When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring Arcano 4925
NaOH Cicarelli 1580110 Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker Biomint BM021
Paraformaldehyde  Biopack 2000959400 Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula Glassco GL-377.303.01
PBS Biopack 2000988800
Plastic Pasteur pipette Daigger 9153
R R Project The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors  Belmed
Sodium azide Biopack 2000163500
Thermometer Daigger 7650

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Barbeito-Andrés, J., Andrini, L., Vallejo-Azar, M., Seguel, S., Devine, J., Hallgrímsson, B., Gonzalez, P. Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains. J. Vis. Exp. (195), e65180, doi:10.3791/65180 (2023).

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