Il trasporto dello zinco si è dimostrato difficile da misurare a causa dei deboli legami causali con la funzione proteica e della bassa risoluzione temporale. Questo protocollo descrive un metodo per monitorare, con alta risoluzione temporale, l’estrusione di Zn 2+ da cellule viventi utilizzando un colorante fluorescente sensibile allo Zn 2+, fornendo così una misura diretta dell’efflusso di Zn2+.
I metalli di transizione come gli ioni Zn2+ devono essere strettamente regolamentati a causa della loro tossicità cellulare. In precedenza, l’attività dei trasportatori di Zn 2+ veniva misurata indirettamente determinando il livello di espressione del trasportatore sotto diverse concentrazioni di Zn2+. Ciò è stato fatto utilizzando l’immunoistochimica, misurando l’mRNA nel tessuto o determinando i livelli cellulari di Zn2+. Con lo sviluppo di sensori intracellulari di Zn 2+, le attività dei trasportatori di zinco sono attualmente determinate principalmente correlando i cambiamenti intracellulari di Zn 2+, rilevati utilizzando sonde fluorescenti, con l’espressione dei trasportatori di Zn2+. Tuttavia, ancora oggi, solo pochi laboratori monitorano i cambiamenti dinamici nello Zn2+ intracellulare e lo utilizzano per misurare direttamente l’attività dei trasportatori di zinco. Parte del problema è che dei 10 trasportatori di zinco della famiglia ZnT, ad eccezione di ZnT10 (trasporta manganese), solo il trasportatore di zinco 1 (ZnT1) è localizzato sulla membrana plasmatica. Pertanto, è difficile collegare l’attività di trasporto ai cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Zn2+. Questo articolo descrive un modo diretto per determinare la cinetica di trasporto dello zinco utilizzando un saggio basato su un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Questo colorante viene caricato nelle cellule di mammifero nella sua forma estere e quindi intrappolato nel citosol a causa dell’attività della diesterasi cellulare. Le cellule sono caricate con Zn 2+ utilizzando lo ionoforo Zn2+ piritione. L’attività di ZnT1 è valutata dalla parte lineare della riduzione della fluorescenza a seguito del washout cellulare. La fluorescenza misurata ad un’eccitazione di 470 nm e un’emissione di 520 nm è proporzionale allo Zn2+ intracellulare libero. La selezione delle cellule che esprimono ZnT1 marcate con il fluoroforo mCherry consente di monitorare solo le cellule che esprimono il trasportatore. Questo saggio viene utilizzato per studiare il contributo di diversi domini della proteina ZnT1 al meccanismo di trasporto della ZnT1 umana, una proteina eucariotica transmembrana che estrude lo zinco in eccesso dalla cellula.
Lo zinco è un oligoelemento essenziale nell’ambiente cellulare. Incorpora un terzo di tutte le proteine ed è coinvolto in vari processi cellulari, come la catalisi1, la trascrizione2 e i motivi strutturali3. Tuttavia, nonostante sia redox-inerte, alte concentrazioni di zinco sono tossiche per la cellula, motivo per cui nessun organismo di mammifero è sopravvissuto senza la presenza di meccanismi che regolano l’omeostasi dello zinco. Nei mammiferi, tre meccanismi sono responsabili di questo processo: (1) metallotioneine, che sono proteine citosoliche ricche di cisteina che legano lo zinco ad un’elevata affinità, prevenendo così l’eccesso di zinco citosolico libero4; (2) Proteine Zrt/Irt-like (ZIPs), che sono trasportatori di zinco responsabili dell’afflusso di zinco nel citosol attraverso la membrana plasmatica o dagli organelli intracellulari 4,5,6,7,8; e (3) ZnT, che sono un sottoinsieme di mammiferi della famiglia dei facilitatori di diffusione cationica ubiquitaria (CDF) e sono trasportatori di zinco, in quanto estrudono lo zinco dal citosol attraverso la membrana plasmatica o negli organelli intracellulari 4,5,6,7,8,9. A causa dell’importanza dello zinco per il metabolismo cellulare, è fondamentale comprendere le dinamiche cellulari dello zinco.
I metodi precedenti per valutare la dinamica dello zinco dipendevano dalla valutazione dei livelli di espressione dell’mRNA in diverse condizioni di zinco, correlandoli con le misurazioni cellulari dello zinco di tessuti o cellule fisse10,11,12. Questi metodi includono il rilevamento chimico e la colorazione immunoistochimica. Tuttavia, questi metodi forniscono solo misure indirette e, quindi, determinano solo una correlazione offline tra la concentrazione intracellulare di zinco e l’espressione dei trasportatori di zinco. Di conseguenza, questi metodi non possono dedurre alcun parametro che richieda un’elevata risoluzione temporale.
Una misurazione più diretta del trasporto di Zn2+ utilizza isotopi radioattivi dello zinco13. Questo metodo si basa sulla misurazione dello Zn2+ radiomarcato per monitorare il trasporto dello zinco e la sua cinetica. Tuttavia, a causa dell’importanza dello zinco per l’omeostasi cellulare, molteplici processi cellulari regolano la concentrazione intracellulare di zinco. Tra questi ci sono il legame extracellulare e diversi sistemi di trasporto che lavorano di concerto per mantenere uno stretto controllo dei livelli intracellulari di Zn2+ . La combinazione di questi processi crea un notevole rumore di fondo, che rende difficile testare le singole funzioni di trasporto legate allo zinco.
Questo articolo illustra un metodo per monitorare direttamente la velocità di trasporto dello zinco misurando la concentrazione intracellulare di zinco libero utilizzando un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Il colorante ha un’elevata specificità per Zn2+ e poca interferenza da altri cationi bivalenti, come il calcio. Inoltre, nella sua forma estere, entra nelle cellule per diffusione non ionica e viene quindi intrappolato a causa dell’attività della diesterasi intracellulare. Pertanto, la sua fluorescenza è correlata principalmente con la concentrazione di zinco citosolico libero. Questi esperimenti sono stati condotti per studiare la relazione struttura-funzione del trasportatore di zinco 1 (ZnT1), un membro della famiglia ZnT.
Il metodo sopra descritto consente la misurazione diretta della concentrazione intracellulare di zinco con un’elevata risoluzione temporale. Rispetto ad altri metodi, questo metodo che prevede il monitoraggio dei cambiamenti nello Zn2+ intracellulare può ridurre sostanzialmente il rumore di fondo. Inoltre, la selettività del colorante per lo zinco elimina le potenziali interazioni incrociate con altri cationi metallici18,19. Infine, la sua mancanza d…
The authors have nothing to disclose.
Raz Zarivach è sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef e Arie Moran sono sostenuti dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 2047/20). Vorremmo ringraziare Daniel Gitler e il suo gruppo all’Università Ben-Gurion per la loro collaborazione, supporto e competenza.
10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
Sigma Aldrich | 31665 |