Summary

Caratterizzazione dei trasportatori di zinco nei mammiferi mediante un saggio di trasporto dello zinco in vitro

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

Il trasporto dello zinco si è dimostrato difficile da misurare a causa dei deboli legami causali con la funzione proteica e della bassa risoluzione temporale. Questo protocollo descrive un metodo per monitorare, con alta risoluzione temporale, l’estrusione di Zn 2+ da cellule viventi utilizzando un colorante fluorescente sensibile allo Zn 2+, fornendo così una misura diretta dell’efflusso di Zn2+.

Abstract

I metalli di transizione come gli ioni Zn2+ devono essere strettamente regolamentati a causa della loro tossicità cellulare. In precedenza, l’attività dei trasportatori di Zn 2+ veniva misurata indirettamente determinando il livello di espressione del trasportatore sotto diverse concentrazioni di Zn2+. Ciò è stato fatto utilizzando l’immunoistochimica, misurando l’mRNA nel tessuto o determinando i livelli cellulari di Zn2+. Con lo sviluppo di sensori intracellulari di Zn 2+, le attività dei trasportatori di zinco sono attualmente determinate principalmente correlando i cambiamenti intracellulari di Zn 2+, rilevati utilizzando sonde fluorescenti, con l’espressione dei trasportatori di Zn2+. Tuttavia, ancora oggi, solo pochi laboratori monitorano i cambiamenti dinamici nello Zn2+ intracellulare e lo utilizzano per misurare direttamente l’attività dei trasportatori di zinco. Parte del problema è che dei 10 trasportatori di zinco della famiglia ZnT, ad eccezione di ZnT10 (trasporta manganese), solo il trasportatore di zinco 1 (ZnT1) è localizzato sulla membrana plasmatica. Pertanto, è difficile collegare l’attività di trasporto ai cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Zn2+. Questo articolo descrive un modo diretto per determinare la cinetica di trasporto dello zinco utilizzando un saggio basato su un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Questo colorante viene caricato nelle cellule di mammifero nella sua forma estere e quindi intrappolato nel citosol a causa dell’attività della diesterasi cellulare. Le cellule sono caricate con Zn 2+ utilizzando lo ionoforo Zn2+ piritione. L’attività di ZnT1 è valutata dalla parte lineare della riduzione della fluorescenza a seguito del washout cellulare. La fluorescenza misurata ad un’eccitazione di 470 nm e un’emissione di 520 nm è proporzionale allo Zn2+ intracellulare libero. La selezione delle cellule che esprimono ZnT1 marcate con il fluoroforo mCherry consente di monitorare solo le cellule che esprimono il trasportatore. Questo saggio viene utilizzato per studiare il contributo di diversi domini della proteina ZnT1 al meccanismo di trasporto della ZnT1 umana, una proteina eucariotica transmembrana che estrude lo zinco in eccesso dalla cellula.

Introduction

Lo zinco è un oligoelemento essenziale nell’ambiente cellulare. Incorpora un terzo di tutte le proteine ed è coinvolto in vari processi cellulari, come la catalisi1, la trascrizione2 e i motivi strutturali3. Tuttavia, nonostante sia redox-inerte, alte concentrazioni di zinco sono tossiche per la cellula, motivo per cui nessun organismo di mammifero è sopravvissuto senza la presenza di meccanismi che regolano l’omeostasi dello zinco. Nei mammiferi, tre meccanismi sono responsabili di questo processo: (1) metallotioneine, che sono proteine citosoliche ricche di cisteina che legano lo zinco ad un’elevata affinità, prevenendo così l’eccesso di zinco citosolico libero4; (2) Proteine Zrt/Irt-like (ZIPs), che sono trasportatori di zinco responsabili dell’afflusso di zinco nel citosol attraverso la membrana plasmatica o dagli organelli intracellulari 4,5,6,7,8; e (3) ZnT, che sono un sottoinsieme di mammiferi della famiglia dei facilitatori di diffusione cationica ubiquitaria (CDF) e sono trasportatori di zinco, in quanto estrudono lo zinco dal citosol attraverso la membrana plasmatica o negli organelli intracellulari 4,5,6,7,8,9. A causa dell’importanza dello zinco per il metabolismo cellulare, è fondamentale comprendere le dinamiche cellulari dello zinco.

I metodi precedenti per valutare la dinamica dello zinco dipendevano dalla valutazione dei livelli di espressione dell’mRNA in diverse condizioni di zinco, correlandoli con le misurazioni cellulari dello zinco di tessuti o cellule fisse10,11,12. Questi metodi includono il rilevamento chimico e la colorazione immunoistochimica. Tuttavia, questi metodi forniscono solo misure indirette e, quindi, determinano solo una correlazione offline tra la concentrazione intracellulare di zinco e l’espressione dei trasportatori di zinco. Di conseguenza, questi metodi non possono dedurre alcun parametro che richieda un’elevata risoluzione temporale.

Una misurazione più diretta del trasporto di Zn2+ utilizza isotopi radioattivi dello zinco13. Questo metodo si basa sulla misurazione dello Zn2+ radiomarcato per monitorare il trasporto dello zinco e la sua cinetica. Tuttavia, a causa dell’importanza dello zinco per l’omeostasi cellulare, molteplici processi cellulari regolano la concentrazione intracellulare di zinco. Tra questi ci sono il legame extracellulare e diversi sistemi di trasporto che lavorano di concerto per mantenere uno stretto controllo dei livelli intracellulari di Zn2+ . La combinazione di questi processi crea un notevole rumore di fondo, che rende difficile testare le singole funzioni di trasporto legate allo zinco.

Questo articolo illustra un metodo per monitorare direttamente la velocità di trasporto dello zinco misurando la concentrazione intracellulare di zinco libero utilizzando un colorante fluorescente specifico per lo zinco, FluoZin-3. Il colorante ha un’elevata specificità per Zn2+ e poca interferenza da altri cationi bivalenti, come il calcio. Inoltre, nella sua forma estere, entra nelle cellule per diffusione non ionica e viene quindi intrappolato a causa dell’attività della diesterasi intracellulare. Pertanto, la sua fluorescenza è correlata principalmente con la concentrazione di zinco citosolico libero. Questi esperimenti sono stati condotti per studiare la relazione struttura-funzione del trasportatore di zinco 1 (ZnT1), un membro della famiglia ZnT.

Protocol

1. Trasfezione cellulare Coltura di cellule HEK293T in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina e 1x penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali) in un incubatore umidificato a 37 °C/5% CO2 fino alla confluenza su una piastra di 10 cm (8,8 x 106 cellule totali). Posizionare un vetrino coprioggetto da 13 mm in ciascuno dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. D…

Representative Results

ZnT1 è un trasportatore di zinco dei mammiferi situato sulla membrana plasmatica cellulare13. È un membro della famiglia delle proteine facilitatore della diffusione cationica (CDF) che estrude lo zinco dal citosol al millieu14 extracellulare. ZnT1 ha un’architettura a due domini: il dominio transmembrana, che trasporta gli ioni attraverso la membrana, e un dominio C-terminale14. A differenza di altre proteine CDF conosciute, ZnT1 ha un dominio C-t…

Discussion

Il metodo sopra descritto consente la misurazione diretta della concentrazione intracellulare di zinco con un’elevata risoluzione temporale. Rispetto ad altri metodi, questo metodo che prevede il monitoraggio dei cambiamenti nello Zn2+ intracellulare può ridurre sostanzialmente il rumore di fondo. Inoltre, la selettività del colorante per lo zinco elimina le potenziali interazioni incrociate con altri cationi metallici18,19. Infine, la sua mancanza d…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Raz Zarivach è sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef e Arie Moran sono sostenuti dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 2047/20). Vorremmo ringraziare Daniel Gitler e il suo gruppo all’Università Ben-Gurion per la loro collaborazione, supporto e competenza.

Materials

10 cm plate greiner bio-one 664160
12-well cell culture plate greiner bio-one 665180
13 mm coverslips Superior Marienfeld 111530
22 mm cover slides Superior Marienfeld 101050
6-well culture plate greiner bio-one 657160
Bovine serum albumin bioWorld 22070008
Calcium chloride anhydrous, granular Sigma Aldrich C1016 Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose Glentham Life Science GC6947 Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)  Sartorius 01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope Nikon TI-DH Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva SH30088.03
Fine tweezers Dumont 0203-55-PS
Fluozin-3AM Invitrogen F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution Cytiva SV30010 
LED illumination system CoolLED pE-4000
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate Merck 1.05833 Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) Formedium HEPES10 Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera ANDOR DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software Nikon AR
Pluronic acid F-127 Millipore 540025
Pottasium chloride Bio-Lab 163823 Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione Sigma Aldrich H3261 Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit Warner Instruments W4 64-0378
Sodium chloride Bio-Lab 190305 Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Sigma Aldrich 31665

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Ben Yosef, T. E., Zarivach, R., Moran, A. Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay. J. Vis. Exp. (196), e65217, doi:10.3791/65217 (2023).

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