Summary

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

Published: August 04, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la procedura per l’editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.

Abstract

I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) dei topi sono uno strumento chiave per studiare la complessa biologia dei macrofagi tissutali. Come cellule primarie, modellano la fisiologia dei macrofagi in vivo più da vicino rispetto alle linee cellulari di macrofagi immortalizzate e possono essere derivate da topi già portatori di cambiamenti genetici definiti. Tuttavia, l’interruzione della funzione genica nei BMDM rimane tecnicamente impegnativa. Qui, forniamo un protocollo per l’editing efficiente del genoma CRISPR/Cas9 nei BMDM, che consente l’introduzione di piccole inserzioni e delezioni (indel) che si traducono in mutazioni frameshift che interrompono la funzione genica. Il protocollo descrive come sintetizzare RNA a guida singola (sgRNA-Cas9) e formare complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 purificati che possono essere rilasciati mediante elettroporazione. Fornisce inoltre un metodo efficiente per monitorare l’efficienza dell’editing utilizzando il sequenziamento Sanger di routine e un programma di analisi online disponibile gratuitamente. Il protocollo può essere eseguito entro 1 settimana e non richiede la costruzione di plasmidi; In genere si traduce in un’efficienza di editing dall’85% al 95%.

Introduction

I macrofagi sono cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo fondamentale nella riparazione dei tessuti e nell’immunità 1,2. Le linee cellulari di macrofagi immortalizzate, come le cellule RAW 264.7 di topo o le cellule THP-1 umane, hanno diverse caratteristiche benefiche, tra cui una crescita robusta e la facilità di distruzione genica fornendo vettori per l’interferenza dell’RNA o CRISPR/Cas9 3,4. Tuttavia, la trasformazione oncogenica altera drammaticamente la loro fisiologia, il che si traduce nell’attivazione aberrante di alcune vie e nelle risposte attenuate di altre 5,6. I macrofagi primari derivati dal midollo osseo (BMDM) ricapitolano più da vicino la fisiologia dei macrofagi in vivo, ma rimangono difficili da manipolare geneticamente a causa della bassa efficienza sia della trasfezione plasmidica che della trasduzione virale in queste cellule immunitarie primarie 7,8. Pertanto, sono necessari metodi più efficienti per interrompere la funzione genica.

L’editing genomico CRISPR/Cas9 è un potente strumento per la manipolazione genetica in una vasta gamma di sistemi biologici, comprese le cellule di mammifero 9,10,11,12. La proteina Cas9 dello Streptococcus pyogenes scinde in modo efficiente e specifico il DNA a doppio filamento quando complessata con un RNA guida specifico per la sequenza. La riparazione del DNA attraverso l’unione non omologa (NHEJ) del DNA scisso provoca piccole inserzioni o delezioni (indel) che creano mutazioni frameshift. Nei primi studi, Cas9 e sgRNA sono stati veicolati attraverso vettori plasmidici o lentivirali, che sono metodi di somministrazione efficaci per molte linee cellulari 9,10. Tuttavia, le cellule primarie e, in particolare, le cellule immunitarie primarie sono spesso refrattarie a questi metodi a causa della bassa efficienza di rilascio del vettore per trasfezione o trasduzione. Successivamente, sono stati sviluppati metodi per generare complessi sgRNA-Cas9 in vitro e per veicolarli tramite elettroporazione, e questi metodi hanno raggiunto un’elevata efficienza in una varietà di tipi cellulari13,14. I risultati hanno suggerito la possibilità di utilizzare questo approccio per effettuare l’editing del genoma nei macrofagi primari.

Qui, forniamo un protocollo per l’utilizzo dei complessi ribonucleoproteici (RNP) sgRNA-Cas9 per effettuare l’editing del genoma nei BMDM primari. Contiene misure per mitigare l’attivazione dei sensori immunitari presenti nelle cellule immunitarie primarie e si traduce in un editing fino al 95% in loci mirati con una tossicità minima. Questo protocollo include anche flussi di lavoro per valutare l’efficienza dell’editing utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) di routine e il sequenziamento Sanger, seguiti dall’analisi in silico mediante Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, uno strumento software online ben convalidato.

Protocol

1. Progettazione dell’sgRNA NOTA: Questo passaggio descrive la selezione delle sequenze bersaglio e la progettazione degli sgRNA. È utile progettare guide che si trovino nel primo grande esone codificante, in modo che qualsiasi proteina tradotta venga interrotta all’inizio del frame di lettura aperto. È anche utile selezionare sequenze target che si trovano all’interno dello stesso esone, in quanto ciò semplificherà l’analisi dell’efficienza di editing (fase 6). Gli esempi d…

Representative Results

Il modello IVT è un prodotto di PCR a 127 bp (Figura 1B). Il prodotto IVT completo è un RNA di 98 nt, che migra in modo simile a un frammento di DNA a doppio filamento di 70 bp (Figura 1C). Dopo l’elettroporazione, le cellule dovrebbero essere vitali al >90%, con un numero totale di cellule del >70% del numero di cellule di partenza. Il pool risultante di cellule mutanti dovrebbe avere un insieme diversificato di indel, a partire da…

Discussion

L’editing del genoma utilizzando complessi Cas9-sgRNA elettroporati consente un’efficace interruzione della funzione genica nei BMDM. L’efficienza di editing varia in base alla sequenza e al gene target. In genere, quattro o cinque sgRNA vengono generalmente sottoposti a screening per identificarne uno altamente attivo. Alcuni loci hanno un’efficienza di editing inferiore, molto probabilmente a causa della struttura della cromatina. In questi casi, è possibile apportare diverse modifiche per aumentare l’efficienza dell’…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH 5R01AI144149. Le figure schematiche sono state create con BioRender.

Materials

3T3-MCSF Cell Line Gift from Russell Vance not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer IDT 1075915
Ampure XP Reagent Beads Beckman Coulter A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase NEB M0525S
DNase NEB M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) Thermo Fisher 14040-133
DPBS -Ca/Mg Thermo Fisher 14190-144
ExoI NEB M0293S
Fetal Calf Serum (FCS) Corning 35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer Agilent 600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit NEB E2040S
LoBind conical tubes 15 mL Eppendorf 30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf 22431102
NEBuffer r2.1 NEB B6002S
Neon Transfection System Thermo Fisher MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips Thermo Fisher MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA Lonza BE02017F
Proteinase K Thermo Fisher EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI NEB B6004S
Ribolock Thermo Fisher EO0384
RNA loading dye NEB B0363S
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
S. pyogenes Cas9-NLS University of California Macro Lab not applicable Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation IDT 1081059
SAP NEB M0371S

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Craft, J., Truong, T., Penn, B. H. High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes. J. Vis. Exp. (198), e65264, doi:10.3791/65264 (2023).

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