Summary

Ritenzione molecolare universale con microscopia ad espansione 11 volte

Published: October 06, 2023
doi:

Summary

Presentata qui è una nuova versione della microscopia ad espansione (ExM), Magnify, che viene modificata per un’espansione fino a 11 volte, conservando una gamma completa di classi di biomolecole ed è compatibile con una vasta gamma di tipi di tessuto. Consente l’interrogazione della configurazione su scala nanometrica delle biomolecole utilizzando microscopi convenzionali limitati alla diffrazione.

Abstract

L’imaging su scala nanometrica di campioni biologici può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. Negli ultimi anni, la microscopia ad espansione (ExM) ha dimostrato di essere un’alternativa efficace e a basso costo alla microscopia ottica a super-risoluzione. Tuttavia, è stato limitato dalla necessità di agenti di ancoraggio specifici e spesso personalizzati per mantenere diverse classi di biomolecole all’interno del gel e dalle difficoltà nell’espandere i formati di campioni clinici standard, come il tessuto incorporato in paraffina fissato in formalina, specialmente se si desiderano fattori di espansione più grandi o epitopi proteici conservati. Qui descriviamo Magnify, un nuovo metodo ExM per un’espansione robusta fino a 11 volte in una vasta gamma di tipi di tessuto. Utilizzando la metacroleina come ancoraggio chimico tra il tessuto e il gel, Magnify trattiene più biomolecole, come proteine, lipidi e acidi nucleici, all’interno del gel, consentendo così l’imaging su larga scala dei tessuti sui microscopi ottici convenzionali. Questo protocollo descrive le migliori pratiche per garantire un’espansione dei tessuti robusta e priva di crepe, nonché suggerimenti per la manipolazione e l’imaging di gel altamente espansi.

Introduction

I sistemi biologici mostrano eterogeneità strutturale, dagli arti e dagli organi fino ai livelli di proteine su scala nanometrica. Pertanto, una comprensione completa del funzionamento di questi sistemi richiede un esame visivo su queste scale dimensionali. Tuttavia, il limite di diffrazione della luce causa difficoltà nella visualizzazione di strutture più piccole di ~ 200-300 nm su un microscopio a fluorescenza convenzionale. Inoltre, i metodi ottici di super-risoluzione 1,2,3, come la deplezione di emissione stimolata (STED), la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) e la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), sebbene potenti, presentano le loro sfide, poiché richiedono hardware e reagenti costosi e spesso hanno tempi di acquisizione lenti e una scarsa capacità di visualizzare grandi volumi in 3D.

La microscopia ad espansione4 (ExM) fornisce un mezzo alternativo per aggirare il limite di diffrazione della luce ancorando covalentemente le biomolecole in un gel polimerico gonfiabile d’acqua e separandole fisicamente, rendendole così risolvibili sui microscopi ottici convenzionali. Una moltitudine di varianti del protocollo ExM sono state sviluppate dalla pubblicazione originale di ExM meno di un decennio fa, e questi protocolli consentono l’incorporazione diretta delle proteine 5,6,7, RNA 8,9,10 o lipidi11,12,13 nella rete di gel alterando l’ancoraggio chimico o espandendo ulteriormente il campione (migliorando così la risoluzione effettiva) in un singolo passaggio14 o in più passaggi iterativi15,16. Fino a poco tempo fa, nessun singolo protocollo ExM poteva mantenere queste tre classi di biomolecole con un singolo ancoraggio chimico disponibile in commercio, fornendo al contempo un gel meccanicamente robusto che poteva espandersi ~ 10 volte in un singolo ciclo di espansione.

Qui, presentiamo Magnify17, una recente aggiunta all’arsenale ExM che utilizza la metacroleina come ancoraggio della biomolecola. La metacroleina forma legami covalenti con tessuti come quello della paraformaldeide, assicurando che più classi di biomolecole possano essere trattenute all’interno della rete di gel senza richiedere vari agenti di ancoraggio specifici o personalizzati. Inoltre, questa tecnica può espandere un ampio spettro di tessuti fino a 11 volte, compresi campioni notoriamente impegnativi come campioni clinici fissati in formalina (FFPE). I metodi precedenti per espandere tali campioni meccanicamente rigidi richiedevano una dura digestione della proteasi, rendendo impossibile l’etichettatura anticorpale delle proteine di interesse dopo che il campione era stato espanso. Al contrario, questa tecnica raggiunge l’espansione dei campioni clinici FFPE utilizzando una soluzione denaturante calda, preservando così gli epitopi proteici interi all’interno del gel, che possono essere mirati per l’imaging post-espansione (Figura 1).

Protocol

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee della Carnegie Mellon University. Sono stati ottenuti commercialmente campioni di tessuto umano. 1. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni stock NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei Materiali per un elenc…

Representative Results

Se il protocollo è stato completato con successo (Figura 1), il campione apparirà chiaro e piatto dopo la denaturazione a caldo; Qualsiasi piegatura o rugosità indica un’omogeneizzazione incompleta. Un campione espanso con successo sarà 3-4,5 volte più grande rispetto a prima dell’espansione in 1x PBS e 8-11 volte più grande quando completamente espanso in ddH2O. La Figura 3 mostra immagini di esempio pre e post-espansione di un campione di rene…

Discussion

Qui, presentiamo il protocollo Magnify 17, una variante ExM che può trattenere più biomolecole con un singolo ancoraggio chimico ed espandere campioni clinici FFPE impegnativi fino a11 volte con denaturazione termica. I cambiamenti chiave in questo protocollo che lo distinguono da altri protocolli ExM includono l’uso di un gel riformulato che rimane meccanicamente robusto anche quando completamente espanso, così come l’uso di metacroleina come ancoraggio della biomolecola. I passaggi più criti…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Carnegie Mellon University e dalla D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), dal National Institutes of Health (N.I.H.) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01, e la Kauffman Foundation.

Materials

4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acrylamide Sigma Aldrich A8887 Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)  Sigma Aldrich A3678 Initiatior
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) Sigma Aldrich P9769 Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M
VWR BDH7830-1 Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine Sigma Aldrich G8898 Homogenization Buffer Component
Heparin Sigma Aldrich H3393
Methacrolein Sigma Aldrich 133035 Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) Sigma Aldrich M7279 Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA) Sigma Aldrich 274135 Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc™ 15mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc™ 50mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientific BP399-1
Polyethylene glycol  200 Sigma Aldrich P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate (SA) AK Scientific R624 Gel Monomer component
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L3771 Homogenization Buffer Component
Tris Base Fischer Scientific BP152-1 Homogenization Buffer Component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Urea Sigma Aldrich U5378 Homogenization Buffer Component
Xylenes Sigma Aldrich 214736
20x SSC Thermo Scientific AM9763
Tween20 Sigma Aldrich P1379
poly-L-lysine  Sigma Aldrich P8920

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Gallagher, B. R., Klimas, A., Cheng, Z., Zhao, Y. Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy. J. Vis. Exp. (200), e65338, doi:10.3791/65338 (2023).

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