Summary

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

Published: September 25, 2023
doi:

Summary

È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l’esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.

Abstract

Questo protocollo presenta un sistema NEVLP ottimizzato privo di eritrociti utilizzando fegati di topo. La conservazione ex vivo dei fegati di topo è stata ottenuta impiegando cannule modificate e tecniche adattate dalle tradizionali apparecchiature commerciali di perfusione ex vivo . Il sistema è stato utilizzato per valutare i risultati di conservazione dopo 12 ore di perfusione. I topi C57BL / 6J sono serviti come donatori di fegato e i fegati sono stati espiantati inannulando la vena porta (PV) e il dotto biliare (BD), e successivamente lavando l’organo con soluzione salina eparinizzata calda (37 ° C). Quindi, i fegati espiantati sono stati trasferiti nella camera di perfusione e sottoposti a perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I campioni di perfusato in ingresso e in uscita sono stati raccolti a intervalli di 3 ore per l’analisi del perfusato. Al termine della perfusione, sono stati ottenuti campioni di fegato per l’analisi istologica, con integrità morfologica valutata utilizzando Suzuki-Score modificato attraverso la colorazione dell’ematossilina-eosina (HE). Gli esperimenti di ottimizzazione hanno prodotto i seguenti risultati: (1) i topi di peso superiore a 30 g sono stati ritenuti più adatti per l’esperimento a causa delle maggiori dimensioni del loro dotto biliare (BD). (2) una cannula in poliuretano da 2 Fr (diametro esterno = 0,66 mm) era più adatta per l’incannulamento della vena porta (PV) rispetto a una cannula in polipropilene. Ciò è stato attribuito alla maggiore presa del materiale poliuretanico, con conseguente riduzione dello slittamento del catetere durante il trasferimento dal corpo alla camera dell’organo. (3) per l’incannulamento del dotto biliare (BD), una cannula in poliuretano da 1 Fr (diametro esterno = 0,33 mm) è risultata più efficace rispetto alla cannula in polipropilene UT – 03 (diametro esterno = 0,30 mm). Con questo protocollo ottimizzato, i fegati di topo sono stati conservati con successo per una durata di 12 ore senza un impatto significativo sulla struttura istologica. La colorazione dell’ematossilina-eosina (HE) ha rivelato un’architettura morfologica ben conservata del fegato, caratterizzata da epatociti prevalentemente vitali con nuclei chiaramente visibili e lieve dilatazione delle sinusoidi epatiche.

Introduction

Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento gold standard per gli individui con malattia epatica allo stadio terminale. Purtroppo, la domanda di organi da donatore supera l’offerta disponibile, portando a una carenza significativa. Nel 2021, circa 24.936 pazienti erano in lista d’attesa per un trapianto di fegato, mentre solo 9.234 trapianti sono stati eseguiti con successo1. La significativa disparità tra l’offerta e la domanda di innesti di fegato evidenzia la pressante necessità di studiare strategie alternative per ampliare il pool di donatori e migliorare l’accessibilità degli innesti di fegato. Un modo per espandere il pool di donatori consiste nell’utilizzare donatori marginali2. I donatori marginali includono quelli con età avanzata, steatosi moderata o grave. Sebbene il trapianto di organi marginali possa produrre risultati favorevoli, i risultati complessivi rimangono non ottimali. Di conseguenza, è attualmente in corso lo sviluppo di strategie terapeutiche volte a migliorare la funzione dei donatori marginali 3,4.

Una delle strategie è quella di utilizzare la perfusione della macchina, in particolare la perfusione della macchina ossigenata normotermica, per migliorare la funzione di questi organi marginali5. Tuttavia, esiste ancora una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che sono alla base degli effetti benefici della perfusione normotermica ossigenata (NEVLP). I topi, con la loro abbondante disponibilità di ceppi geneticamente modificati, servono come modelli preziosi per studiare i percorsi molecolari. Ad esempio, l’importanza delle vie autofagiche nel mitigare il danno da ischemia-riperfusione epatica è stata sempre più riconosciuta 6,7. Un’importante via molecolare nel danno da ischemia-riperfusione epatica è la via 8 di miR-20b-5p/ATG7. Attualmente, sono disponibili un certo numero di ceppi di topi knockout ATG e knock-out condizionali, ma nessun ceppo di ratto corrispondente9.

Sulla base di questo background, l’obiettivo era quello di generare una piattaforma NEVLP miniaturizzata per innesti di fegato di topo. Questa piattaforma faciliterebbe l’esplorazione e la valutazione di potenziali strategie geneticamente modificate volte a migliorare la funzionalità del fegato del donatore. Inoltre, era essenziale che il sistema fosse adatto alla perfusione a lungo termine, consentendo il trattamento ex vivo del fegato, comunemente indicato come “riparazione d’organo”.

Considerando la limitata disponibilità di dati in vitro rilevanti sulla perfusione epatica di topo, la revisione della letteratura si è concentrata su studi condotti sui ratti. Una ricerca sistematica della letteratura che va dal 2010 al 2022 è stata eseguita utilizzando parole chiave come “perfusione epatica normotermica”, “ex vivo o in vitro” e “ratti“. Questa ricerca mirava a identificare le condizioni ottimali nei roditori, permettendoci di determinare l’approccio più appropriato.

Il sistema di perfusione è costituito da un serbatoio tampone di vetro sigillato con camicia d’acqua, una pompa a rulli peristaltica, un ossigenatore, una trappola a bolle, uno scambiatore di calore, una camera d’organo e un sistema di tubi ciclici chiusi (Figura 1). Il sistema garantisce il mantenimento preciso di una temperatura di perfusione costante di 37 °C utilizzando una macchina termostatica dedicata. La pompa a rulli peristaltici guida il flusso del perfusato in tutto il circuito. Il circuito di perfusione inizia nel serbatoio isolato con camicia d’acqua. Successivamente, il perfusato viene diretto attraverso l’ossigenatore, che riceve una miscela di gas del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica da una bombola di gas dedicata. Dopo l’ossigenazione, il perfusato passa attraverso la trappola a bolle, in cui eventuali bolle intrappolate vengono reindirizzate al serbatoio dalla pompa peristaltica. Il perfusato rimanente scorre attraverso lo scambiatore di calore ed entra nella camera dell’organo, da dove ritorna al serbatoio.

Qui, riportiamo le nostre esperienze nella creazione di un NEVLP per fegati di topo e condividiamo i risultati promettenti di un esperimento pilota eseguito utilizzando il mezzo ossigenato senza vettori di ossigeno.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le attuali normative e linee guida tedesche per il benessere degli animali e le linee guida ARRIVE per la segnalazione della ricerca sugli animali. Il protocollo di sperimentazione animale è stato approvato dal Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Germania (numero di approvazione: UKJ – 17 – 106). NOTA: I topi maschi C57BL/6J del peso di 34 ± 4 g (errore medio ± standard della media [SEM]) sono stati utilizzati come…

Representative Results

Istituzione della procedura chirurgicaUn totale di 17 animali sono stati utilizzati per questo esperimento: 14 topi sono stati impiegati per ottimizzare il processo di approvvigionamento degli organi, compreso l’incannulamento della vena porta (PV) e del dotto biliare (BD), mentre 3 topi sono stati utilizzati per convalidare la procedura (Tabella 1). I risultati istologici (Figura 3) sono stati confrontati per facilitare l’identificazione della condizion…

Discussion

Passaggi critici nel protocollo
I due passaggi cruciali nell’espianto di fegato sono l’incannulamento della vena porta (PV) e il successivo incannulamento del dotto biliare (BD). Questi passaggi sono di fondamentale importanza per garantire il successo del prelievo degli organi e delle successive procedure di perfusione o trapianto.

Sfide e soluzioni
L’incannulamento fotovoltaico presenta tre sfide: lesione della parete del vaso, spostamento del catetere…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Durante la stesura di questo documento, ho ricevuto un grande sostegno e assistenza. Vorrei ringraziare in particolare il mio compagno di squadra XinPei Chen per la sua meravigliosa collaborazione e il supporto paziente durante la mia operazione.

Materials

0.5 ml Micro Tube PP Sarstedt 72699
1 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
10 µL Micro Syringe Hamilton 701N
2 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula Terumo SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula Terumo SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle Sterican 100246
50 ml Syringe Pump Braun 110356
6-0 Perma-Hand Seide Ethicon 639H
Arterial Clip Braun BH014R
Autoclavable Moist Chamber Hugo Sachs Elektronik 73-4733
Big Cotton Applicator  NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974018
Bubble Trap Hugo-Sachs-Elektronik V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml) Elanco /
CIDEX OPA solution (2 L) Cilag GmbH 20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C ERBE /
Fetal Bovine Serum(500 ml)  Sigma-Aldrich F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) House Supply /
Heating Circulating Baths Harvard-Apparatus 75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) Braun 1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) Pfizer 15427276
Insulin(100 IE / ml) Sigma I0516-5ML
Iris Scissors  Fine Science Instruments 15000-03
Isofluran (250 ml) Cp-Pharma 1214
Membrane Oxygenator Hugo Sachs Elektronik T18728
Microsurgery Microscope  Leica M60
Mouse Retractor Set  Carfil Quality 180000056
NanoZoomer 2.0 HT Hamamatsu /
Non-Woven Sponges  Kompressen 866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)  C.C.Pro Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm) Braun 4256000
Peristaltic Pump Harvard-Apparatus P-70
Petri Dishc 100×15 mm VWR® 391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) Livisto 799-416
Pressure Transducer Simulator UTAH Medical Products 650-950
Reusable Blood Pressure Transducers AD Instruments MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps Fine Science Instruments 00608-11
Small Cotton Applicator NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974116
Straight Forceps 10 cm  Fine Science Instruments 00632-11
Suture Tying Forceps Fine Science Instruments 11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor Braun 8728810F-06
UT – 03 Cannula Unique Medical, Japan /
Vannas Spring Scissors Fine Science Instruments 15018-10
Veterinary Saline (500 ml) WDT 18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L Harvard-Apparatus 73-3441
William's E Medium (500 ML) Thermofischer Scientific A1217601

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Citazione di questo articolo
Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M., Ana, P. H., Dahmen, U. Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65363, doi:10.3791/65363 (2023).

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