Summary

Ingegneria genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens di microalghe verdi, Chlorella vulgaris

Published: October 27, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo delinea l’utilizzo della trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) per l’integrazione di geni di interesse nel genoma nucleare della microalga verde Chlorella vulgaris, portando alla produzione di trasformanti stabili.

Abstract

La trasformazione mediata dall’Agrobacterium tumefaciens (AMT) funge da strumento ampiamente utilizzato per manipolare i genomi delle piante. Tuttavia, A. tumefaciens mostra la capacità di trasferimento genico a una vasta gamma di specie. Numerose specie di microalghe non dispongono di metodi consolidati per integrare in modo affidabile i geni di interesse nel loro genoma nucleare. Per sfruttare i potenziali benefici della biotecnologia delle microalghe, sono fondamentali strumenti di manipolazione del genoma semplici ed efficienti. In questo articolo, viene presentato un protocollo AMT ottimizzato per la specie di microalghe industriali Chlorella vulgaris, utilizzando la proteina fluorescente verde reporter (mGFP5) e il marcatore di resistenza agli antibiotici per l’igromicina B. I mutanti sono selezionati attraverso la placcatura su terreni Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contenenti igromicina B e cefotaxima. L’espressione di mGFP5 è quantificata tramite fluorescenza dopo oltre dieci generazioni di subcoltura, indicando la trasformazione stabile della cassetta T-DNA. Questo protocollo consente la generazione affidabile di più colonie transgeniche di C. vulgaris in meno di due settimane, impiegando il vettore di espressione vegetale pCAMBIA1302 disponibile in commercio.

Introduction

L’Agrobacterium tumefaciens, un batterio gram-negativo trasmesso dal suolo, possiede una capacità unica di trasferimento genico tra regni, che gli è valsa il titolo di “ingegnere genetico naturale”1. Questo batterio può trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide che induce il tumore (Ti-Plasmide) nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo IV, con conseguente integrazione ed espressione del T-DNA all’interno del genoma ospite 1,2,3,4. Nell’ambiente naturale, questo processo porta alla formazione di tumori nelle piante, comunemente noti come malattia della galla della corona. Tuttavia, l’Agrobacterium può anche trasferire il T-DNA in vari altri organismi, tra cui lieviti, funghi, alghe, embrioni di ricci di mare e persino cellule umane in condizioni di laboratorio 5,6,7,8.

Sfruttando questo sistema naturale, la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens (AMT) consente l’integrazione casuale di geni di interesse nel genoma nucleare di una cellula ospite modificando la regione T-DNA del plasmide Ti. A questo scopo, un vettore di espressione delle piante AMT ampiamente utilizzato è pCAMBIA13029. I ricercatori possono utilizzare semplici flussi di lavoro di clonazione in E. coli prima di trasferire il vettore desiderato in A. tumefaciens per il successivo trasferimento all’ospite di interesse.

Le microalghe verdi sono eucarioti che condividono molte somiglianze con le piante terrestri, ma sono altamente recalcitranti alla modificazione genetica. Tuttavia, la trasformazione genetica svolge un ruolo cruciale sia nella ricerca di base che in quella biotecnologica delle microalghe. In diverse specie di microalghe, in particolare Chlamydomonas reinhardtii, la trasformazione genetica tramite AMT ha introdotto con successo transgeni come l’interleuchina-2 umana (hIL-2), il dominio legante il recettore 2 del coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2 RBD) e due peptidi antimicrobici (AMP)10,11,12,13. Tra queste, la Chlorella vulgaris, una specie di alga verde meno esigente e a crescita rapida, ha un potenziale significativo per la produzione sostenibile di carboidrati, proteine, nutraceutici, pigmenti e altri composti di alto valore14. Tuttavia, la mancanza di strumenti affidabili per la creazione di ceppi transgenici di C. vulgaris ostacola il suo progresso commerciale. Poiché è stato pubblicato solo un numero limitato di lavori che utilizzano AMT in C. vulgaris15, e date le notevoli differenze tra la coltivazione di piante e microalghe, l’ottimizzazione del protocollo AMT diventa essenziale.

In questo studio, i ricercatori hanno inserito la proteina fluorescente verde (mGFP5) a valle del promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (CamV) e hanno aggiunto un tag di istidina per utilizzarlo come gene reporter per l’espressione proteica. I trasformanti sono stati selezionati utilizzando l’igromicina B e, dopo la subcoltura per oltre venti generazioni, la trasformazione è rimasta stabile. Il plasmide pCAMBIA1302 impiegato in questo lavoro può essere facilmente adattato per contenere qualsiasi gene di interesse. Inoltre, il metodo e i materiali presentati possono essere adattati per altre specie di alghe verdi con un promotore attivo CamV35S, poiché questo promotore viene utilizzato per la selezione dell’igromicina.

Protocol

Tutti i terreni e le soluzioni devono essere sterilizzati in autoclave prima dell’uso, salvo diversa indicazione. Tutte le provette da centrifuga, i puntali delle pipette, ecc., devono essere sterili o sterilizzati in autoclave prima dell’uso. Per una facile consultazione, le ricette dei terreni utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella 1. 1. Preparazione di cellule elettrocompetenti di A. tumefaciens Inoculare Agrobac…

Representative Results

Per dimostrare il successo della trasformazione utilizzando il metodo di cui sopra, C. vulgaris è stato co-coltivato con AGL-1 contenente il plasmide pCAMBIA1302 o senza il plasmide (wild-type e placcato su agar TAP integrato con igromicina B e cefotaxima (Figura 1A). La placca più a sinistra mostra le colonie trasformate in grado di crescere sulle piastre di igromicina B/cefotaxima, mentre la placca centrale mostra che l’AGL-1 wild-type non può crescere sulle piastre di igromici…

Discussion

L’efficienza della trasformazione è associata a diversi parametri. La scelta dei ceppi di A. tumefaciens utilizzati per l’AMT è fondamentale. AGL-1 è uno dei ceppi più invasivi scoperti e, per questo motivo, è stato utilizzato abitualmente nell’AMT vegetale. Anche l’integrazione del mezzo di induzione con glucosio (15-20 mM) è importante per l’efficienza dell’AMT. Considerando che C. vulgaris può crescere sia in condizioni fototrofiche che eterotrofe, il glucosio o altre fonti di carbonio vengono…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Paul Hooykaas per aver gentilmente fornito il vettore pCAMBIA1302 e l’Agrobacterium tumefaciens AGL1 dell’Istituto di Biologia di Leida, Università di Leiden, Paesi Bassi. Gli autori desiderano anche ringraziare Eva Colic per il suo aiuto nella crescita dei trasformanti fluorescenti. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e dal programma Mitacs Accelerate.

Materials

1 Kb Plus DNA ladder FroggaBio DM015
Acetosyringone Fisher Scientific D26665G
Agrobacterium tumefaciens Gold Biotechnologies Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin Enzo Life Sciences 89151-400
CaCl2·2H2O VWR BDH9224-1KG
Cefotaxime AK Scientific J90010
Chlorella vulgaris University of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395 Wildtype strain
CoCl2·6H2O Sigma Aldrich C8661-25G
CuSO4·5H2O EMD Millipore CX2185-1
FeCl3·6H2O VWR BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator Bio-Rad 1652662 Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit Thermo Scientific K0791
Glacial acetic acid VWR CABDH3093-2.2P
Glycerol BioBasic GB0232
HEPES Buffer Sigma Aldrich H-3375
Hygromycin B Fisher Scientific AAJ6068103
K2HPO4 VWR BDH9266-500G
Kanamycin Gold Biotechnologies K-250-25
KH2PO4 VWR BDH9268-500G
MgSO4·7H2O VWR 97062-134
MnCl2·4H2O JT Baker BAKR2540-01
Na2CO3 VWR BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O JT Baker 8993-01
Na2MoO2H2O JT Baker BAKR3764-01
NaCl VWR BDH7257-7
NaH2PO4 H2O Millipore Sigma CA80058-650
NaNO VWR BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin NewEngland BioLabs NEB #S1427
NH4Cl VWR BDH9208-500G
pCAMBIA1302 Leiden University Gift from Prof. Paul Hooykaas pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL) QIAGEN 34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL Bio-Rad 1610363
Rifampicin Millipore Sigma R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch  SunBlaster 210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer  BioTEK S4MLFPTA
Tetracycline Thermo Scientific Chemicals CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610185
Thiamine TCI America T0181-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Tryptone BioBasic TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin) Enzo Life Sciences 89151-436
Yeast Extract BioBasic G0961
ZnSO4·7H2O JT Baker 4382-01

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Roushan, M. R., Chen, C., Ahmadi, P., Ward, V. C. A. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris. J. Vis. Exp. (200), e65382, doi:10.3791/65382 (2023).

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