Summary

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Questo articolo descrive un metodo per l’isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l’analisi dell’espressione proteica.

Abstract

Il sistema linfatico partecipa alla regolazione della sorveglianza immunitaria, dell’assorbimento dei lipidi e dell’equilibrio dei liquidi tissutali. L’isolamento delle cellule endoteliali linfatiche murine è un processo importante per la ricerca linfatica, in quanto consente l’esecuzione di esperimenti in vitro e biochimici sulle cellule isolate. Inoltre, lo sviluppo della tecnologia Cre-lox ha permesso la carenza tessuto-specifica di geni che non possono essere bersagliati a livello globale, portando alla determinazione precisa del loro ruolo nei tessuti studiati. La dissezione del ruolo di alcuni geni nella fisiologia linfatica e nella fisiopatologia richiede l’uso di promotori linfatici-specifici e, quindi, la verifica sperimentale dei livelli di espressione dei geni bersaglio.

I metodi per l’isolamento efficiente di cellule endoteliali linfatiche da topi wild-type o transgenici consentono l’uso di saggi ex vivo e in vitro per studiare i meccanismi che regolano le funzioni linfatiche e l’identificazione dei livelli di espressione delle proteine studiate. Abbiamo sviluppato, standardizzato e presentato un protocollo per l’isolamento efficiente di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine (DLEC) tramite purificazione con biglie magnetiche basato sull’espressione di LYVE-1. Il protocollo delineato mira a fornire ai ricercatori uno strumento per comprendere e chiarire ulteriormente gli attori importanti delle funzioni delle cellule endoteliali linfatiche, in particolare nelle strutture in cui non sono disponibili apparecchiature di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza.

Introduction

Il sistema linfatico svolge un ruolo fondamentale nella fisiologia umana. È considerato un fattore omeostatico vitale, che facilita funzioni importanti, come il mantenimento dell’equilibrio dei fluidi tissutali-plasmatici, la sorveglianza immunitaria e l’assorbimento dei lipidi1, nonché funzioni recentemente identificate, come la capacità di riparazione del cuore2 e la capacità rigenerativa dell’osso e l’emopoiesi3. Nonostante il ruolo significativo del sistema linfatico, diversi aspetti del ruolo dei linfatici, così come i meccanismi molecolari che governano alcuni parametri fisiologici e le risposte, rimangono sfuggenti. Inoltre, i difetti vascolari linfatici sono fattori scatenanti o deterioranti in determinate condizioni fisiopatologiche. Esempi ben noti sono i linfedemi primari e secondari, a seconda dell’origine genetica o non genetica della malattia, rispettivamente, mentre il ruolo del sistema linfatico sulla crescita del tumore primario e sulla disseminazione metastatica è fondamentale, in quanto può fungere da condotto per le metastasi e modulatore delle funzioni immunitarie1.

Il ritardo nello studio e nella conoscenza del sistema linfatico rispetto al sistema vascolare del sangue è dovuto principalmente alla successiva scoperta del sistema linfatico rispetto al sistema vascolare del sangue e al ritardo nell’identificazione di marcatori molecolari linfatico-specifici. Questo è notevolmente migliorato negli ultimi decenni, portando all’alterazione del quadro convenzionale dei linfatici allo stato stazionario e in condizioni di malattia1. Analogamente all’angiogenesi, la linfangiogenesi è la formazione di nuovi vasi linfatici da quelli preesistenti e svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di un ampio spettro di malattie 4,5,6. Tuttavia, a differenza dell’angiogenesi, lo studio della linfangiogenesi è stato limitato a modelli per lo più in vivo, concentrandosi sulla formazione dei vasi di sviluppo e sui difetti strutturali in modelli patologici. L’isolamento delle cellule endoteliali linfatiche è importante per gli studi in vitro e questo può essere fornito dal protocollo presentato.

Sono stati sviluppati diversi protocolli per l’isolamento dell’endotelio linfatico dai topi, che richiedono l’uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza7. Il vantaggio del selezionatore cellulare, ove disponibile, è il grado di purezza più elevato, contrariamente all’isolamento basato su microsfere, con quest’ultimo che fornisce una resa maggiore. Il protocollo utilizza l’espressione del recettore 1 dell’acido ialuronico endoteliale linfatico (LYVE-1), un marcatore endoteliale linfatico, importante per il traffico cellulare all’interno dei vasi linfatici 4,8. Poiché l’espressione di LYVE-1 è limitata ai capillari linfatici e non ai vasi linfatici collettori, la tecnica è adatta per l’isolamento delle cellule endoteliali linfatiche specificamente dai capillari linfatici, contrariamente ad altri marcatori linfatici, come la podoplanina, che sono espressi uniformemente in tutte le cellule endoteliali linfatiche9. Per il protocollo, sono stati esclusi altri importanti marcatori linfatici che non erano transmembrana, come Prox1.

Poiché l’esito fisiologico era la linfangiogenesi, che di solito inizia a livello dei capillari linfatici, LYVE-1 è stato selezionato come bersaglio a causa della sua selettività in queste cellule e perché l’anticorpo selezionato forniva un’elevata resa. Gli enzimi utilizzati erano la collagenasi di tipo II, che è generalmente nota per essere più efficace nella dissociazione del collagene rispetto al tipoI 10, e la dispasi, una proteasi più ampia, regolarmente utilizzata per la separazione derma-epidermide11; Tuttavia, sono stati riportati altri enzimi per la separazione dei tessuti12,13 e possono essere utilizzati. L’obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per l’isolamento delle cellule endoteliali linfatiche dermiche dai capillari linfatici di topi adulti con alta resa utilizzando la purificazione con biglie magnetiche, specialmente in luoghi in cui la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza non è prontamente disponibile. Il metodo è adatto per applicazioni in cui la purezza delle cellule endoteliali linfatiche può essere compromessa per le applicazioni a valle.

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) per gli esperimenti presso il TTUHSC e dall’Amministrazione veterinaria della Prefettura della Grecia occidentale secondo la direttiva 2010/63 per gli esperimenti presso l’Università di Patrasso. Seguire diligentemente le norme sullo smaltimento dei rifiuti durante lo smaltimento dei materiali di scarto animale. <p class="jove_ti…

Representative Results

Il metodo è stato sviluppato per identificare l’espressione proteica di una piccola GTPasi, RhoA, il cui gene codificante è stato floxato in entrambi gli alleli e deleto sotto l’effetto del promotore endoteliale specifico dell’endotelio linfatico inducibile dal tamoxifene Prox1-CreERT2 18. Le LEC isolate possono essere coltivate per un massimo di quattro generazioni, dopodiché diventano senescenti. Sono stati congelati, scongelati e stimolati con successo con angiopoietina-2…

Discussion

Il sistema linfatico è un importante regolatore della funzione omeostatica del corpo, con le funzioni più importanti che sono il mantenimento del plasma fluido, la rimozione dei sottoprodotti del metabolismo cellulare e delle molecole tossiche, l’assorbimento dei lipidi e il traffico delle cellule immunitarie 1,19. L’identificazione di marcatori appropriati ha provocato un’esplosione di nuovi dati nel campo linfatico, rivelando nuove funzioni del sistema vascol…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione ellenica per la ricerca e l’innovazione (00376), dal National Institutes of Health, dal National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], dalla Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences grant (a CMM) e dal College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up funding, il National Institutes of Health (NIH) attraverso il National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] e il Research Competitiveness Subprogram (RCS) del Louisiana Board of Regents attraverso il Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (a G.M.). Le comuni apparecchiature TTUHSC utilizzate sono state ottenute attraverso le sovvenzioni del Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) RP190524 e RP200572. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, nella decisione di scrivere o nella preparazione del manoscritto. L’abstract grafico nella Figura 1A è stato creato con BioRender.com.

Materials

0.2 μm Syringe Filters Fisher Scientific 09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes Fisher Scientific FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes Fisher Scientific FB012921
Animal Hair Clipper Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x Fisher Scientific 15240-062
Blunt Forceps Fine Science Tools 11992-20
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4919
Cell Strainer 40 μm Fisher Scientific 542040
Cell Strainer 70 μm Fisher Scientific 542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail Corning 354249 dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II Life Technologies 17101-015
Dispase Life Technologies 17105-041
DMEM Fisher Scientific 11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL) Thermo Scientific 90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator Invitrogen 120-21D
EDTA Sigma-Aldrich 3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium) R&D Systems CCM027
Euthanasia chamber Euthanex Corporation
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fine Scissors-Sharp Fine Science Tools 14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody Biolegend 123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads New England Biolabs S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads Thermo Scientific 21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS Fisher Scientific AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1 ReliaTech GmbH 103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes Corning 352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores Fisher Scientific 09-719C
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25-300-120

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Akwii, R. G., Lamprou, M., Georgomanoli, M., Plevriti, A., Marazioti, A., Mouzaki, A., Mattheolabakis, G., Mikelis, C. M. Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation. J. Vis. Exp. (197), e65393, doi:10.3791/65393 (2023).

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