Summary

Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Published: December 01, 2023
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Summary

Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).

Abstract

Le cellule staminali embrionali umane (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) hanno potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa basata sulle cellule per il trattamento di organi gravemente malati grazie alla loro proliferazione illimitata e alle loro proprietà pluripotenti. Tuttavia, la differenziazione delle cellule ES/iPS umane in tipi di cellule bersaglio pure al 100% è impegnativa a causa della loro elevata sensibilità all’ambiente. La tumorigenesi dopo il trapianto è causata da cellule contaminate, proliferanti e indifferenziate, rendendo la tecnologia ad alta purificazione essenziale per la realizzazione sicura della medicina rigenerativa. Per mitigare il rischio di tumorigenesi, è stata sviluppata una tecnologia ad alta purificazione per gli epatociti derivati da cellule iPS umane. Il metodo utilizza FACS (fluorescence-activated cell sorting) utilizzando una combinazione di alto contenuto mitocondriale e il marcatore di superficie cellulare ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) senza modificazioni genetiche. Il 97% ± lo 0,38% (n = 5) degli epatociti purificati utilizzando questo metodo hanno mostrato espressione proteica di albumina. Questo articolo si propone di fornire procedure dettagliate per questo metodo, come applicato al più recente metodo di differenziazione bidimensionale per cellule iPS umane in epatociti.

Introduction

Le cellule staminali embrionali e pluripotenti indotte (ES e iPS, rispettivamente) sono considerate fonti cellulari promettenti per le terapie rigenerative. Tuttavia, l’efficienza della differenziazione di queste cellule in specifici tipi di cellule bersaglio può variare, anche quando si utilizza la stessa linea cellulare, lo stesso protocollo e lo stesso sperimentatore 1,2,3,4. Questa variabilità può essere attribuita all’elevata sensibilità delle cellule ES/iPS umane al loro ambiente. Pertanto, attualmente è difficile ottenere costantemente cellule bersaglio pure. Per ottenere una medicina rigenerativa altamente sicura, è fondamentale eliminare le cellule proliferative e le cellule staminali indifferenziate nelle cellule terapeutiche ed è essenziale una tecnologia avanzata di purificazione per le cellule bersaglio 5,6,7.

Un selezionatore di cellule è un dispositivo che analizza istantaneamente le singole cellule e ordina le cellule vive di interesse in base all’intensità del segnale fluorescente, offrendo una soluzione promettente. Ciò può essere ottenuto attraverso la colorazione con anticorpi di marcatori di superficie specifici per il tipo di cellula o utilizzando espressioni geniche reporter specifiche per il tipo di cellula. Utilizzando questa tecnica, ci sono diversi rapporti su metodi per purificare i cardiomiociti 8,9,10 e gli epatociti11,12 derivati da cellule staminali pluripotenti. Hattori et al. hanno sviluppato un innovativo metodo di purificazione mitocondriale utilizzando un selezionatore di cellule13. Sfruttando il fatto che i cardiomiociti hanno un’elevata richiesta di energia attraverso l’attività mitocondriale, la colorazione delle cellule con il colorante mitocondriale vivo TMRM (estere metilmetilico-rodamina) può essere utilizzato per marcare e purificare altamente i cardiomiociti mediante FACS da corpi embrioidi derivati da cellule ES umane contenenti vari tipi di cellule. L’assenza di tumorigenicità è stata confermata da saggi di formazione di teratomi con i cardiomiociti purificati. Inoltre, Yamashita et al. hanno inaspettatamente scoperto un metodo per purificare gli epatociti da corpi embrioidi derivati da cellule ES umane isolando frazioni con elevata attività mitocondriale ed espressione ALCAM-positiva14. Il razionale di questo metodo è che gli epatociti hanno anche un numero relativamente alto di mitocondri a causa del loro elevato consumo di ATP per il metabolismo dei nutrienti e la disintossicazione15, e gli epatociti esprimono ALCAM, un membro della superfamiglia delle immunoglobuline, che svolge un ruolo nell’adesione e nella migrazione cellulare16.

I precedenti metodi altamente purificanti per gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti richiedevano modificazioni genetiche e i metodi di purificazione non genetici avevano una bassa efficienza17. Il metodo non genetico mitocondriale ha il merito di raggiungere un’elevata purezza. Quando sono necessarie cellule progenitrici epatiche, è possibile scegliere i metodi CD133 e CD13 o Dlk1 18,19. Sebbene l’accuratezza della tecnologia di editing del genoma sia avanzata, il potenziale rischio di cambiamenti genomici imprevisti (ad esempio, la cancerogenesi) non può essere completamente eliminato. I metodi basati sull’attività mitocondriale, senza comportare modificazioni genetiche, possono essere esenti da tali rischi.

Come risultato dell’esame di vari indicatori mitocondriali nei cardiomiociti neonatali di ratto, è stato osservato che il TMRM scompare completamente entro 24 ore, mentre altri coloranti sono rimasti per almeno 5 giorni13. Inoltre, è importante notare che TMRM e JC-1 non hanno influenzato la vitalità cellulare quando valutati con il test 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), mentre altri coloranti hanno dimostrato effetti variabili sulla vitalità cellulare13. TMRM dimostra una maggiore sicurezza.

Ad oggi, sono stati sviluppati diversi metodi di differenziazione bidimensionale (2D) come approcci più efficienti per indurre la differenziazione rispetto alla formazione di corpi embrioidi tridimensionali (3D). Questo perché i composti o le citochine che inducono la differenziazione graduale possono essere somministrati uniformemente alle cellule su un piano 2D, piuttosto che in uno spazio 3D. In questo studio, il metodo20 precedentemente riportato è stato modificato per indurre la differenziazione in epatociti derivati da cellule iPS umane. Qui vengono descritti i dettagli delle procedure per la differenziazione e la purificazione 2D aggiornate di epatociti derivati da cellule iPS umane.

Protocol

Questo studio ha utilizzato cellule iPS umane ottenute commercialmente (ceppo 253G1) (vedi Tabella dei materiali). 1. Mantenimento delle cellule iPS umane Mantenere le cellule iPS umane in condizioni prive di alimentatore in terreno AK02 su piastre di coltura rivestite con iMatrix-511 da 0,25 μg/cm2 (vedere la tabella dei materiali). 2. Differenziamento epatico di cellule iPS umane …

Representative Results

Viene mostrata la cronologia dei processi che inducono le cellule iPS umane a differenziarsi in epatociti attraverso la coltura 2D (Figura 1A) e le caratteristiche cellulari rappresentative (Figura 1B). Approssimativamente il 12° giorno di differenziazione, le cellule hanno iniziato a mostrare forme cellulari poligonali e nuclei rotondi, caratteristici degli epatociti. Alcuni epatociti mostravano anche multinucleazione. L’analisi FAC…

Discussion

A causa delle loro funzioni nel metabolismo dei nutrienti e nella disintossicazione, gli epatociti possiedono un numero relativamente elevato di mitocondri rispetto ad altri tipi di cellule15. ALCAM è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline e svolge un ruolo nell’adesione e nella migrazione cellulare. È espresso in vari tipi di cellule, tra cui cellule epatiche, epiteliali, linfocitiche, mieloidi, fibroblasti e neuronali16. Utilizzando una combinazione del met…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia numero di sovvenzione [23390072].

Materials

253G1 human iPS cell line RIKEN BioResource Research Center HPS0002
4% paraformaldehyde FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant NACALAI TESQUE, INC. 18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Chemicon MAB1281 Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
CHIR-99021 MedChemExpress HY-10182 
Ciclosporin A FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 035-18961
Collagenase FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-24023 ROCK inhibitor
Dexamethasone FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
Fetal Bovine Serum Biowest 51820-500
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody R&D Systems AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H2270
iMatrix-511 silk Nippi 892021
ImmunoBlock KAC CTKN001 Blocking solution
ITS-G Supplement(×100) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 090-06741
Leibovitz's L-15 Medium FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) Toronto Research Chemicals H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin Dako A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20) NACALAI TESQUE, INC. 28353-85
RPMI-1640 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 189-02025
Sodium L-Ascorbate NACALAI TESQUE, INC. 03422-32
StemFit AK02N REPROCELL RCAK02N
TBS (10x) NACALAI TESQUE, INC. 12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Thermo Fisher Scientific T668
Triton X-100 NACALAI TESQUE, INC. 28229-25
Trypan Blue Solution NACALAI TESQUE, INC. 20577-34
TRYPSIN 250 Difco 215240
Tryptose phosphate broth solution Sigma-Aldrich T8159

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Citazione di questo articolo
Yamashita, H., Hattori, F. Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e65777, doi:10.3791/65777 (2023).

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