Summary

Lesione da congelamento nel muscolo massetere del topo per stabilire un modello di fibrosi muscolare orofacciale

Published: December 29, 2023
doi:

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è stabilire un modello di fibrosi muscolare orofacciale. Il confronto dell’istologia tra il massetere dei topi e il muscolo tibiale anteriore dopo la lesione da congelamento ha confermato la fibrosi del muscolo massetere. Questo modello faciliterà ulteriori indagini sul meccanismo alla base della fibrosi muscolare orofacciale.

Abstract

Il muscolo orofacciale costituisce un sottoinsieme del tessuto muscolare scheletrico, con una traiettoria evolutiva e un’origine di sviluppo distinte. A differenza dei muscoli degli arti di derivazione somite, i muscoli orofacciali originano dagli archi branchiali, con contributi esclusivi dalla cresta neurale cranica. Un recente studio ha rivelato che la rigenerazione è diversa anche nel gruppo dei muscoli orofacciali. Tuttavia, il meccanismo di regolamentazione sottostante deve ancora essere scoperto. Gli attuali modelli di rigenerazione del muscolo scheletrico si concentrano principalmente sul muscolo dell’arto e del tronco. In questo protocollo, il ghiaccio secco è stato utilizzato per indurre lesioni da congelamento nel muscolo massetere del topo e nel muscolo tibiale anteriore per creare un modello di fibrosi muscolare orofacciale. Le dinamiche temporali delle cellule satelliti muscolari e dei progenitori fibro-adipogenici erano diverse tra i due muscoli, portando a una ridotta rigenerazione delle miofibre e a un’eccessiva deposizione di matrice extracellulare. Con l’aiuto di questo modello, è stato possibile condurre un’indagine più approfondita sulla rigenerazione muscolare nell’area orofacciale per sviluppare approcci terapeutici per i pazienti con malattie orofacciali.

Introduction

I muscoli orofacciali sono fondamentali nelle attività fisiologiche quotidiane come la masticazione, la parola, la respirazione e l’espressione facciale1. Nelle deformità orofacciali congenite, tuttavia, questi muscoli mostrano alterazioni atrofiche e fibrotiche, che portano a una compromissione della salute corporea e della cognizione sociale2. La chirurgia ricostruttiva facciale rimane il trattamento di prima linea, ma fino al 30-70% dei pazienti postoperatori soffre ancora di perdita muscolare e disfunzione muscolare 3,4 Il fallimento della rigenerazione muscolare orofacciale è stato attribuito a fattori intrinseci, che non possono essere corretti dalla sola chirurgia.

L’emergere dei muscoli orofacciali è una novità evolutiva, che accompagna la complessa testa dei vertebrati e il cuore a camera 5,6. A differenza delle loro controparti degli arti di derivazione somite, i muscoli orofacciali originano dall’arco branchiale7. Questi caratteri filogenetici e ontogenetici possono predisporli a comportamenti rigenerativi distinti8. È stato riportato che il muscolo massetere (MAS) ha sviluppato una grave fibrosi nel momento in cui il muscolo tibiale anteriore (TA) si è completamente rigenerato dopo l’esposizione nella stessa entità della lesione 1,9. Tuttavia, il meccanismo alla base della rigenerazione rimane poco compreso.

In questo studio, è stato stabilito un modello di lesione da congelamento del muscolo massetere del topo per facilitare l’indagine sulla rigenerazione del muscolo orofacciale. Abbiamo scelto 14 giorni dopo l’infortunio come punto temporale per valutare il fenotipo della fibrosi poiché era il primo punto temporale in cui era rilevabile una divergenza distinguibile tra due muscoli. La rigenerazione completa della MAS dopo l’infortunio richiede almeno 40 settimane1. Coerentemente, questo studio ha rivelato una notevole deposizione di collagene a seguito di lesione da congelamento di MAS rispetto alla regolare rigenerazione del TA a 14 giorni dopo l’infortunio. Con l’aiuto di questo modello, è possibile effettuare ulteriori studi meccanicistici sull’atrofia muscolare e sulla fibrosi, che a loro volta aiuteranno lo sviluppo di potenziali vie terapeutiche per promuovere la rigenerazione muscolare orofacciale dopo l’intervento chirurgico.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2020-114). I topi maschi C57BL/6 (5 settimane di età) sono stati allevati in una struttura a umidità controllata (53 ± 2%) e a temperatura controllata (23 ± 2 °C) e hanno seguito un ciclo luce/buio di 12 ore. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, reagenti e strumenti utilizzati in questo prot…

Representative Results

La colorazione HE e Sirius Red (Figura 4 e Figura S1 supplementare) ha rivelato la completa rigenerazione muscolare dell’AT in questo modello di lesione da congelamento. Al contrario, la MAS mostrava un’alterata rigenerazione delle miofibre e un’eccessiva deposizione di matrice extracellulare. L’istologia dei muscoli MAS e TA intatti è mostrata nella Figura 4A, B, dove le miofibre sono allineate e l’area fibrot…

Discussion

Esistono una varietà di modelli di lesioni per lo studio della rigenerazione del muscolo scheletrico, incluso l’uso di stimoli fisici, chimici e chirurgici 10,11,12,13,14,15,16. La cardiotossina e il cloruro di bario sono le due sostanze chimiche più utilizzate per avviare la rigenerazione…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Comitato provinciale per la salute e il benessere del Sichuan (numero di sovvenzione: 21PJ063) e della National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione: 82001031).

Materials

1 mL syringe Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China) 1-ml syringe /
Acetone Chron Chemicals Aceton /
Adhesion microscope slides Citotest Scientific 188105 /
Animal depilatory Phygene Scientific PH1877 /
BSA (bovine serum albumin) Solarbio Life Sciences A8010 /
DAPI Solarbio Life Sciences C0065 /
Donkey anti-goat Alexa Fluor 488 Abcam ab150129 1:200
donkey serum Solarbio Life Sciences SL050 /
Dry Ice Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) rice-shaped dry ice /
IFKine Red Donkey anti-rabbit Abbkine Scientific Company A24421 1:200
Insulation barrels (big) Thermos D600 /
Insulation barrels (small) Polar Ware 250B /
Isoflurane RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China) R510-22 /
Isopentane MACKLIN M813375 /
Laminin Sigma-Aldrich L9393 1:1000
Liquid nitrogen Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) / /
M.O.M kit Vector Laboratories BMK-2202
Mice   Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China) 5 weeks old /
mounting medium Solarbio Life Sciences S2100 /
Nertral balsam Solarbio Life Sciences G8590 /
Pax7 Developmental Studies Hybridoma Bank  Pax7 1:5
Pdgfra R&D systems AF1062 1:40
Sirus Red Staining Kit Solarbio Life Sciences G1472 /
Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture) Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China) / /
Tissue-tek OCT Sakura 4583 /
Triton Shanghai Scigrace Biotech ABIO-Biofroxx-0006A /
Zoletil Virbac Zoletil 50 /

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Cheng, X., Huang, Y., Li, Y., Li, J., Wang, Y. Freezing Injury in Mouse Masseter Muscle to Establish an Orofacial Muscle Fibrosis Model. J. Vis. Exp. (202), e65847, doi:10.3791/65847 (2023).

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