Viene fornito un protocollo dettagliato per la pulizia e il riutilizzo delle provette per ultracentrifuga in policarbonato per eseguire l’isolamento delle vescicole extracellulari adatto per esperimenti di proteomica.
Le plastiche monouso da laboratorio aggravano la crisi dell’inquinamento e contribuiscono ai costi dei materiali di consumo. Nell’isolamento delle vescicole extracellulari (EV), le provette per ultracentrifuga in policarbonato (UC) vengono utilizzate per sopportare le elevate forze centrifughe associate. La proteomica EV è un campo in progresso e mancano protocolli di riutilizzo convalidati per questi tubi. Il riutilizzo dei materiali di consumo per i protocolli di isolamento delle proteine a basso rendimento e la proteomica a valle richiede la compatibilità dei reagenti con le acquisizioni di spettroscopia di massa, come l’assenza di contaminazione da polimeri sintetici derivati da provette da centrifuga e una sufficiente rimozione delle proteine residue.
Questo protocollo descrive e convalida un metodo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per il riutilizzo in esperimenti di proteomica EV. Il processo di pulizia prevede l’immersione immediata dei tubi UC in H2O per prevenire l’essiccazione delle proteine, il lavaggio in detergente dodecilsolfato di sodio (SDS) allo 0,1%, il risciacquo in acqua calda del rubinetto, acqua demineralizzata ed etanolo al 70%. Per convalidare il protocollo di riutilizzo delle provette UC per la proteomica delle vescicole extracellulari a valle, sono state ottenute provette usate a seguito di un esperimento che isolava le vescicole extracellulari dal tessuto cardiovascolare utilizzando la colite ulcerosa differenziale e la separazione del gradiente di densità. Le provette sono state pulite e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni EV confrontando provette UC vuote mai utilizzate con provette UC pulite. I pellet pseudo-EV ottenuti dalle procedure di isolamento sono stati lisati e preparati per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem utilizzando un kit di preparazione del campione proteico commerciale con modifiche per campioni proteici a bassa abbondanza.
Dopo la pulizia, il numero di proteine identificate è stato ridotto del 98% nello pseudo-pellet rispetto al precedente campione di isolamento EV dalla stessa provetta. Confrontando una provetta pulita con una provetta vuota, entrambi i campioni contenevano un numero molto piccolo di proteine (≤20) con una somiglianza dell’86%. È stata confermata l’assenza di picchi polimerici nei cromatogrammi delle provette pulite. In definitiva, la validazione di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all’arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e abbasserà i costi sperimentali.
Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle delimitate da doppio strato lipidico rilasciate da cellule che trasportano carichi biologicamente attivi, come le proteine, e partecipano a vari processi biologici, tra cui la comunicazione cellula-cellula e la formazione di mineralizzazione biologica1. Queste particelle si trovano in tutti i fluidi e tessuti corporei e le loro attività biologiche e usi sono un campo di ricerca scientifica in rapida evoluzione. L’isolamento e la convalida di queste nanoparticelle presentano varie sfide a causa delle loro piccole dimensioni e della biosimilarità con altre particelle, come liposomi e aggregati proteici. Le più recenti linee guida della Società Internazionale delle Vescicole Extracellulari, Informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 (MISEV2018), sono lo standard riconosciuto per la ricerca scientifica sulle vescicole extracellulari2.
Per l’isolamento delle vescicole extracellulari devono essere utilizzati vari metodi, spesso in tandem, a seconda della sorgente a monte e delle applicazioni a valle. A partire dal 2015, il metodo di isolamento primario più comune per le vescicole extracellulari era l’ultracentrifugazione differenziale (UC)2. In linea di principio, la centrifugazione iniziale a bassa velocità separa i componenti indesiderati più grandi o più densi, come cellule e detriti cellulari, lasciando le vescicole extracellulari nel surnatante. Successivamente, l’UC utilizza una forza centrifuga molto elevata per estrarre e quindi separare e purificare le vescicole extracellulari da altre particelle più piccole o meno dense, ma che possono contenere anche particelle dense non EV. La maggior parte dei protocolli utilizzerà spesso, in un passaggio o nell’altro, l’UC per isolare le vescicole extracellulari da un fluido3. Inoltre, l’UC viene utilizzato in altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari, come l’ultracentrifugazione a gradiente di densità (DGUC), che utilizza mezzi come lo iodixanolo OptiprepTM e la forza centrifuga per separare le vescicole extracellulari in base alla loro densità di galleggiamento4. Esistono altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari3.
Considerando la rapida evoluzione della comprensione dei processi biologici dettati dalle vescicole extracellulari e il loro potenziale come biomarcatori e informazioni riguardanti la fisiopatologia, le analisi basate sulla scoperta come la proteomica hanno guadagnato terreno 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari sono piccole e, a seconda della fonte, hanno una bassa resa di proteine (<1 μg) rispetto al tessuto intero o al lisato cellulare. L'isolamento delle vescicole extracellulari per l'analisi proteomica richiede considerazioni speciali, come la rimozione di contaminanti proteici non EV da liquidi o tessuti a monte, la considerazione della degradazione delle proteine EV durante il processo di isolamento e l'utilizzo di metodi che creano soluzioni proteiche chimicamente compatibili con la preparazione di peptidi e le analisi di spettrometria di massa.
I materiali di consumo del laboratorio di ricerca sono spesso di plastica e di natura usa e getta. Questi materiali monouso contribuiscono alla crisi globale dell’inquinamento da plastica e ai costi dei materiali di consumo. I tubi UC specializzati in policarbonato e polistirene sono progettati per resistere alle elevate forze centrifughe richieste per pellettare i veicoli elettrici nelle applicazioni di laboratorio. Sebbene sia possibile sterilizzare e disinfettare le provette per colite ulcerosa per il riutilizzo, l’analisi proteomica, in particolare quelle a bassa resa proteica come le vescicole extracellulari, richiede un’attenzione speciale. Non solo è fondamentale una sufficiente rimozione delle proteine residue dall’uso precedente, ma deve essere considerata anche la compatibilità chimica con la spettroscopia di massa e la contaminazione da polimeri derivati dalla plastica.
Qui presentiamo un protocollo di pulizia dei tubi in policarbonato utilizzando detergenti adatti alla spettrometria di massa ed eseguiamo esperimenti per convalidare la sua rimozione di proteine residue al di sotto dei limiti di rilevamento e mancanza di contaminanti polimerici rilevabili. Per convalidare il protocollo di pulizia per applicazioni proteomiche EV utilizzando sia scopi UC che DGUC, abbiamo ottenuto provette da isolamenti di vescicole extracellulari di tessuto vascolare umano con un protocollo combinato UC e DGUC. Le provette sono state pulite utilizzando il protocollo descritto e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni confrontando una provetta UC vuota mai utilizzata e una provetta UC pulita. In definitiva, la convalida di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all’arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e ridurrà i costi associati a tali esperimenti.
Qui descriviamo e convalidiamo un protocollo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per l’arricchimento di veicoli elettrici e applicazioni proteomiche. Abbiamo dimostrato il successo della rimozione della proteina residua dal precedente campione di provetta UC rispetto a un’analisi pseudo-pellet pulita al di sotto del limite di rilevamento di questo protocollo di acquisizione con spettrometria di massa e abbiamo mostrato la somiglianza proteomica della provetta UC vuota mai utilizzata rispetto agli pseudo pellet de…
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca del National Institutes of Health (NIH) R01HL147095, R01HL141917 e R01HL136431, Kowa Company, Ltd. e del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 101023041 (R. Cahalane). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com. L’attuale protocollo di pulizia è stato sviluppato modificando un protocollo di pulizia del tubo raccomandato presentato alla Giornata dell’educazione (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) 2023 della Società internazionale delle vescicole extracellulari. Molte grazie alla dott.ssa Kathryn Howe e alla dott.ssa Sneha Raju dell’University Health Network (Università di Toronto, Canada) per i campioni originali di vescicole extracellulari del tessuto carotideo.
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
MilliQ water | water | ||
PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |