Summary

Riutilizzo della provetta per ultracentrifuga in policarbonato nelle analisi proteomiche delle vescicole extracellulari

Published: March 08, 2024
doi:

Summary

Viene fornito un protocollo dettagliato per la pulizia e il riutilizzo delle provette per ultracentrifuga in policarbonato per eseguire l’isolamento delle vescicole extracellulari adatto per esperimenti di proteomica.

Abstract

Le plastiche monouso da laboratorio aggravano la crisi dell’inquinamento e contribuiscono ai costi dei materiali di consumo. Nell’isolamento delle vescicole extracellulari (EV), le provette per ultracentrifuga in policarbonato (UC) vengono utilizzate per sopportare le elevate forze centrifughe associate. La proteomica EV è un campo in progresso e mancano protocolli di riutilizzo convalidati per questi tubi. Il riutilizzo dei materiali di consumo per i protocolli di isolamento delle proteine a basso rendimento e la proteomica a valle richiede la compatibilità dei reagenti con le acquisizioni di spettroscopia di massa, come l’assenza di contaminazione da polimeri sintetici derivati da provette da centrifuga e una sufficiente rimozione delle proteine residue.

Questo protocollo descrive e convalida un metodo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per il riutilizzo in esperimenti di proteomica EV. Il processo di pulizia prevede l’immersione immediata dei tubi UC in H2O per prevenire l’essiccazione delle proteine, il lavaggio in detergente dodecilsolfato di sodio (SDS) allo 0,1%, il risciacquo in acqua calda del rubinetto, acqua demineralizzata ed etanolo al 70%. Per convalidare il protocollo di riutilizzo delle provette UC per la proteomica delle vescicole extracellulari a valle, sono state ottenute provette usate a seguito di un esperimento che isolava le vescicole extracellulari dal tessuto cardiovascolare utilizzando la colite ulcerosa differenziale e la separazione del gradiente di densità. Le provette sono state pulite e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni EV confrontando provette UC vuote mai utilizzate con provette UC pulite. I pellet pseudo-EV ottenuti dalle procedure di isolamento sono stati lisati e preparati per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem utilizzando un kit di preparazione del campione proteico commerciale con modifiche per campioni proteici a bassa abbondanza.

Dopo la pulizia, il numero di proteine identificate è stato ridotto del 98% nello pseudo-pellet rispetto al precedente campione di isolamento EV dalla stessa provetta. Confrontando una provetta pulita con una provetta vuota, entrambi i campioni contenevano un numero molto piccolo di proteine (≤20) con una somiglianza dell’86%. È stata confermata l’assenza di picchi polimerici nei cromatogrammi delle provette pulite. In definitiva, la validazione di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all’arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e abbasserà i costi sperimentali.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle delimitate da doppio strato lipidico rilasciate da cellule che trasportano carichi biologicamente attivi, come le proteine, e partecipano a vari processi biologici, tra cui la comunicazione cellula-cellula e la formazione di mineralizzazione biologica1. Queste particelle si trovano in tutti i fluidi e tessuti corporei e le loro attività biologiche e usi sono un campo di ricerca scientifica in rapida evoluzione. L’isolamento e la convalida di queste nanoparticelle presentano varie sfide a causa delle loro piccole dimensioni e della biosimilarità con altre particelle, come liposomi e aggregati proteici. Le più recenti linee guida della Società Internazionale delle Vescicole Extracellulari, Informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 (MISEV2018), sono lo standard riconosciuto per la ricerca scientifica sulle vescicole extracellulari2.

Per l’isolamento delle vescicole extracellulari devono essere utilizzati vari metodi, spesso in tandem, a seconda della sorgente a monte e delle applicazioni a valle. A partire dal 2015, il metodo di isolamento primario più comune per le vescicole extracellulari era l’ultracentrifugazione differenziale (UC)2. In linea di principio, la centrifugazione iniziale a bassa velocità separa i componenti indesiderati più grandi o più densi, come cellule e detriti cellulari, lasciando le vescicole extracellulari nel surnatante. Successivamente, l’UC utilizza una forza centrifuga molto elevata per estrarre e quindi separare e purificare le vescicole extracellulari da altre particelle più piccole o meno dense, ma che possono contenere anche particelle dense non EV. La maggior parte dei protocolli utilizzerà spesso, in un passaggio o nell’altro, l’UC per isolare le vescicole extracellulari da un fluido3. Inoltre, l’UC viene utilizzato in altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari, come l’ultracentrifugazione a gradiente di densità (DGUC), che utilizza mezzi come lo iodixanolo OptiprepTM e la forza centrifuga per separare le vescicole extracellulari in base alla loro densità di galleggiamento4. Esistono altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari3.

Considerando la rapida evoluzione della comprensione dei processi biologici dettati dalle vescicole extracellulari e il loro potenziale come biomarcatori e informazioni riguardanti la fisiopatologia, le analisi basate sulla scoperta come la proteomica hanno guadagnato terreno 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari sono piccole e, a seconda della fonte, hanno una bassa resa di proteine (<1 μg) rispetto al tessuto intero o al lisato cellulare. L'isolamento delle vescicole extracellulari per l'analisi proteomica richiede considerazioni speciali, come la rimozione di contaminanti proteici non EV da liquidi o tessuti a monte, la considerazione della degradazione delle proteine EV durante il processo di isolamento e l'utilizzo di metodi che creano soluzioni proteiche chimicamente compatibili con la preparazione di peptidi e le analisi di spettrometria di massa.

I materiali di consumo del laboratorio di ricerca sono spesso di plastica e di natura usa e getta. Questi materiali monouso contribuiscono alla crisi globale dell’inquinamento da plastica e ai costi dei materiali di consumo. I tubi UC specializzati in policarbonato e polistirene sono progettati per resistere alle elevate forze centrifughe richieste per pellettare i veicoli elettrici nelle applicazioni di laboratorio. Sebbene sia possibile sterilizzare e disinfettare le provette per colite ulcerosa per il riutilizzo, l’analisi proteomica, in particolare quelle a bassa resa proteica come le vescicole extracellulari, richiede un’attenzione speciale. Non solo è fondamentale una sufficiente rimozione delle proteine residue dall’uso precedente, ma deve essere considerata anche la compatibilità chimica con la spettroscopia di massa e la contaminazione da polimeri derivati dalla plastica.

Qui presentiamo un protocollo di pulizia dei tubi in policarbonato utilizzando detergenti adatti alla spettrometria di massa ed eseguiamo esperimenti per convalidare la sua rimozione di proteine residue al di sotto dei limiti di rilevamento e mancanza di contaminanti polimerici rilevabili. Per convalidare il protocollo di pulizia per applicazioni proteomiche EV utilizzando sia scopi UC che DGUC, abbiamo ottenuto provette da isolamenti di vescicole extracellulari di tessuto vascolare umano con un protocollo combinato UC e DGUC. Le provette sono state pulite utilizzando il protocollo descritto e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni confrontando una provetta UC vuota mai utilizzata e una provetta UC pulita. In definitiva, la convalida di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all’arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e ridurrà i costi associati a tali esperimenti.

Protocol

1. Pulizia del tubo NOTA: La procedura di isolamento EV utilizza tubi UC in policarbonato con e senza tappo (descritti di seguito). La stessa procedura è stata seguita sia per le provette tappate che per quelle non tappate. Nel caso dei tubi tappati, le parti del coperchio sono state pulite singolarmente e rimontate dopo l’asciugatura e il pre-stoccaggio. Dopo l’uso iniziale delle provette in policarbonato e la rimozione del campione, immergere immediatamente le pro…

Representative Results

Per convalidare il protocollo di pulizia (Figura 1), sono stati eseguiti due esperimenti. In primo luogo, il proteoma del “campione simulato” dalla provetta pulita è stato confrontato con il proteoma del campione EV di tessuto dall’uso iniziale della provetta per determinare il carryover delle proteine identificate. I cromatogrammi rappresentativi mostrano una riduzione dell’eterogeneità dei picchi dopo la pulizia delle provette (Figura 2). Nell’isolamento ori…

Discussion

Qui descriviamo e convalidiamo un protocollo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per l’arricchimento di veicoli elettrici e applicazioni proteomiche. Abbiamo dimostrato il successo della rimozione della proteina residua dal precedente campione di provetta UC rispetto a un’analisi pseudo-pellet pulita al di sotto del limite di rilevamento di questo protocollo di acquisizione con spettrometria di massa e abbiamo mostrato la somiglianza proteomica della provetta UC vuota mai utilizzata rispetto agli pseudo pellet de…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca del National Institutes of Health (NIH) R01HL147095, R01HL141917 e R01HL136431, Kowa Company, Ltd. e del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 101023041 (R. Cahalane). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com. L’attuale protocollo di pulizia è stato sviluppato modificando un protocollo di pulizia del tubo raccomandato presentato alla Giornata dell’educazione (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) 2023 della Società internazionale delle vescicole extracellulari. Molte grazie alla dott.ssa Kathryn Howe e alla dott.ssa Sneha Raju dell’University Health Network (Università di Toronto, Canada) per i campioni originali di vescicole extracellulari del tessuto carotideo.

Materials

10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube Beckman Coulter Life Sciences 355630 uncapped ultracentrifuge tube(s) 
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter Life Sciences 355603 capped ultracentrifuge tube(s) 
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm ThermoFisher Scientific 164946 and ES902 Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head VWR 89031-270 cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.   ThermoFisher Scientific BRE725533 Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) NA NA Human database
MilliQ water water
PreOmics iST kit   PreOmics P.O.00027 commercial protein sample preparation kit 
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5) ThermoFisher Scientific NA Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm  NA NA Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%) Boston BioProducts BM-230 detergent

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Cahalane, R. M. E., Turner, M. E., Clift, C. L., Blaser, M. C., Bogut, G., Levy, S., Kasai, T., Driedonks, T. A. P., Nolte-‘t Hoen, E. N. M., Aikawa, M., Singh, S. A., Aikawa, E. Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (205), e66126, doi:10.3791/66126 (2024).

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