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Summary

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull’imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Abstract

I condensati biomolecolari formati tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS) sono stati considerati critici nell’organizzazione cellulare e in un numero crescente di funzioni cellulari. La caratterizzazione delle LLPS nelle cellule vive è importante anche perché la condensazione aberrante è stata collegata a numerose malattie, tra cui tumori e disturbi neurodegenerativi. La LLPS è spesso guidata da interazioni selettive, transitorie e multivalenti tra proteine intrinsecamente disordinate. Di grande interesse sono le dinamiche di interazione delle proteine che partecipano alle LLPS, che sono ben riassunte dalle misurazioni del loro tempo di residenza di legame (RT), cioè la quantità di tempo che trascorrono legate all’interno dei condensati. Qui, presentiamo un metodo basato sull’imaging di singole molecole di cellule vive che ci consente di misurare la RT media di una specifica proteina all’interno dei condensati. Visualizziamo simultaneamente le singole molecole proteiche e i condensati a cui si associano, utilizziamo il tracciamento di singole particelle (SPT) per tracciare le traiettorie delle singole molecole e quindi adattiamo le traiettorie a un modello di legame proteina-gocciolina per estrarre l’RT medio della proteina. Infine, mostriamo risultati rappresentativi in cui questo metodo di imaging a singola molecola è stato applicato per confrontare gli RT medi di una proteina nei suoi condensati LLPS quando fusa e non fusa in un dominio oligomerizzante. Questo protocollo è ampiamente applicabile alla misurazione delle dinamiche di interazione di qualsiasi proteina che partecipa alle LLPS.

Introduction

Un numero crescente di lavori suggerisce che i condensati biomolecolari svolgono un ruolo importante nell’organizzazione cellulare e in numerose funzioni cellulari, ad esempio la regolazione trascrizionale 1,2,3,4,5, la riparazione del danno al DNA ^6,7,8, l’organizzazione della cromatina 9,10,11,12, il cromosoma X inattivazione 13,14,15 e segnalazione intracellulare 16,17,18. Inoltre, la disregolazione dei condensati biomolecolari è implicata in molte malattie, tra cui i tumori 19,20,21 e le malattie neurodegenerative 22,23,24,25,26. La formazione di condensa è spesso guidata da interazioni transienti, selettive e multivalenti proteina-proteina, proteina-acido nucleico o acido nucleico-acido nucleico²⁷. In determinate condizioni, queste interazioni possono portare alla separazione di fase liquido-liquido (LLPS), una transizione di densità che arricchisce localmente biomolecole specifiche in goccioline prive di membrana. Tali interazioni multivalenti sono spesso mediate dalle regioni intrinsecamente disordinate (IDR) delle proteine ^1,28,29. La caratterizzazione biofisica di queste interazioni a livello molecolare è fondamentale per la nostra comprensione di numerose funzioni cellulari sane e aberranti, data la pervasività dei condensati attraverso di esse. Sebbene le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza confocale, ad esempio il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP)30,31,32, siano state ampiamente utilizzate per dimostrare qualitativamente che gli scambi molecolari tra i condensati e l’ambiente cellulare circostante sono dinamici, quantificare le dinamiche di interazione di specifiche biomolecole all’interno dei condensati non è generalmente possibile utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a singola molecola microscopia senza metodi specializzati di analisi dei dati. La tecnica di tracciamento di singole particelle (SPT) descritta in questo protocollo si basa sulla microscopia a singola molecola di cellule vive³³ e fornisce uno strumento straordinariamente potente per quantificare le dinamiche di interazione tra proteine specifiche all’interno dei condensati. La lettura dell’SPT per tale misurazione è il tempo medio di permanenza di una proteina di interesse nei condensati.

Il protocollo può essere suddiviso in due parti: acquisizione e analisi dei dati. Il primo passo dell’acquisizione dei dati di imaging è quello di esprimere nelle cellule una proteina di interesse che viene fusa con un HaloTag³⁴. Ciò consente di marcare la proteina di interesse con due fluorofori, dove la maggior parte delle molecole proteiche devono essere marcate con un fluoroforo non fotoattivabile (ad esempio, JFX549 Halo ligando³⁵) e una piccola frazione di esse deve essere marcata con un fluoroforo spettralmente distinto e fotoattivabile (ad esempio, PA-JF646 Halo ligando³⁶). Ciò consente l’acquisizione simultanea di tutte le posizioni dei condensati nella cellula e l’acquisizione di film a singola molecola della proteina di interesse che si lega e si dislega ai condensati. Nel frattempo, lo stesso tipo di cellule viene modificato per esprimere stabilmente H2B con Halo-tagged, un istone che è in gran parte immobile sulla cromatina. Le cellule vengono quindi colorate con il ligando PA-JF646 Halo per consentire l’imaging di una singola molecola di H2B. Come verrà discusso in dettaglio in seguito, questo esperimento tiene conto del contributo del fotosbiancamento per consentire una quantificazione precisa delle dinamiche di interazione della proteina di interesse. Le cellule per gli esperimenti di imaging devono quindi essere coltivate su vetrini coprioggetti puliti, colorate con ligandi HaloTag e assemblate in una camera di imaging per cellule vive. Da lì, il campione viene ripreso sotto l’illuminazione di un foglio ottico altamente inclinato e laminato (HILO) su un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) in grado di eseguire l’imaging a due canali e il rilevamento di una singola molecola. L’emissione viene quindi suddivisa su due telecamere, una che traccia le posizioni del condensato e una che traccia le singole molecole. L’acquisizione viene eseguita con un lungo tempo di integrazione (dell’ordine di centinaia di ms) per offuscare le proteine che diffondono liberamente e catturare solo le proteine che sono meno mobili a causa del legame con strutture stabili nella cellula³⁷.

Il primo passo dell’analisi dei dati consiste nell’utilizzare un algoritmo di tracciamento a singola particella (SPT)^38,39 per localizzare le singole molecole proteiche in ogni fotogramma del filmato e assemblare le localizzazioni in una traiettoria per ciascuna molecola nel corso della sua vita rilevabile. Le traiettorie vengono quindi ordinate in quelle che rappresentano le molecole all’interno e quelle che rappresentano le molecole all’esterno dei condensati confrontando le localizzazioni delle molecole lungo le loro traiettorie con le localizzazioni di tutti i condensati nei tempi corrispondenti¹.

Successivamente, viene generata una curva di sopravvivenza (1 – CDF) utilizzando le lunghezze di tutte le traiettorie in condensa. Il tempo medio apparente di permanenza delle molecole viene quindi estratto adattando la curva di sopravvivenza al seguente modello esponenziale a due componenti di legame proteico,

,

con A come frazione di molecole non specificamente legate e con k_obs,ns e k_obs,s come i tassi di dissociazione osservati delle molecole non specificamente legate e specificamente legate, rispettivamente. Da qui in poi vengono considerati solo k_obs,s . La dinamica sia della dissociazione proteica, k_true,s, che del fotosbiancamento del fluoroforo, k_pb, contribuisce a k_obs,s come

;

quindi, per isolare gli effetti della dissociazione proteica, viene misurato il tasso di dissociazione specifico di H2B-Halo nella linea cellulare menzionata in precedenza.

L’H2B è una proteina che è stabilmente integrata nella cromatina e che sperimenta una dissociazione minima nella scala temporale dell’acquisizione di un film a singola molecola³⁷. Il suo tasso di dissociazione specifica è quindi uguale al tasso di fotosbiancamento del ligando PA-JF646 Halo, o

.

Il tempo medio di permanenza nel condensato della proteina di interesse, , è quindi

.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et ^al.40 , dove questo protocollo è stato applicato per dimostrare che la fusione di un dominio di oligomerizzazione con l’IDR si traduce in tempi di permanenza più lunghi dell’IDR nei suoi condensati. Questo risultato suggerisce che il dominio di oligomerizzazione aggiunto stabilizza le interazioni omotipiche dell’IDR che guida le LLPS. In linea di principio, lo stesso metodo con protocolli leggermente modificati può essere applicato per caratterizzare le interazioni omotipiche o eterotipiche di qualsiasi proteina che partecipi alla formazione di qualsiasi tipo di condensato.

Protocol

1. Marcatura delle proteine nelle cellule Esprimere la proteina di interesse fusa con HaloTag nella linea cellulare desiderata. Esprime stabilmente H2B con tag alogeno nello stesso tipo di cellule di cui alla versione 1.1 utilizzando trasposoni o trasduzione virale. 2. Preparazione dei vetrini coprioggetti Prima di utilizzare i vetrini coprioggetti per la coltura cellulare, pulire i vetrini coprioggetti per rimuovere i conta…

Representative Results

Qui, presentiamo i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40, dove abbiamo utilizzato questo protocollo SPT per confrontare le dinamiche di interazione di due proteine nei rispettivi condensati LLPS auto-assemblati. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) contiene un IDR che può essere sottoposto a LLPS in seguito a sovraespressione nelle cellule umane. Abbiamo ipotizzato che la fusione di TAF15 (IDR) con FTH1 (catena pesante di ferritina 1), che forma un oligomero a 24 subu…

Discussion

Il protocollo qui presentato è progettato per sistemi come quelli studiati in Irgen-Gioro et ^al.40. A seconda dell’applicazione, alcuni componenti del protocollo possono essere modificati, ad esempio il metodo per generare linee cellulari marcate con fluorescenza, il sistema di marcatura fluorescente e lo stile di vetrino coprioggetto utilizzato. L’halo-tagging di una proteina in una cellula può essere fatto usando due strategie, a seconda di quale sia più adatta per un determinato esperimento….

Materials

0.1 µm TetraSpeck microsphere	Invitrogen	T7279	Single-molecule imaging
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips	Marienfeld Superior	111650	Preparation of coverslips
593/40 nm bandpass filter	Semrock	FF01-593/40-25	Single-molecule imaging
676/37 nm bandpass filter	Semrock	FF01-676/37-25	Single-molecule imaging
6-Well TC Plate	Genesee	25-105MP	Preparation of cells for microscopy
Cell Line: U-2 OS	ATCC	HTB-96	Labeling of proteins in cells
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Coverglass Staining Rack	Thomas	24957	Preparation of coverslips
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
DMEM, Low Glucose	Gibco	10-567-022	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope	Nikon		Single-molecule imaging
Ethanol 200 Proof	Lab Alley	EAP200-1GAL	Preparation of coverslips
evalSPT			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH30396.03	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Fiji			Analysis of single-molecule imaging data
Ikon Ultra CCD Camera	Andor	X-13723	Single-molecule imaging
Longpass dichroic beamsplitter	Semrock	Di02-R635-25×36	Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter
LUN-F Laser Unit	Nikon		Single-molecule imaging: 405/488/561/640
MatTek glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-20-C	Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.
NIS-Elements	Nikon		Single-molecule imaging: Microscope acquisition software
nucleus and cluster mask_v2.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15-140-122	Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	18912014	Labeling of proteins in cells
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)	Janelia Research Campus		Preparation of cells for microscopy
PLOT_ResidenceHist_css.m			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
Potassium Hydroxide	Mallinckrodt Chemicals	6984-06	Preparation of coverslips
pretracking_comb.txt			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018
SLIMfast			Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016
Stage-top incubation system	Tokai Hit		Single-molecule imaging: For live-cell imaging
TwinCam dual emission image splitter	Cairn Research		Single-molecule imaging
Ultrasonic Cleaner	Branson	5800	Preparation of coverslips