È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull’imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.
I condensati biomolecolari formati tramite separazione di fase liquido-liquido (LLPS) sono stati considerati critici nell’organizzazione cellulare e in un numero crescente di funzioni cellulari. La caratterizzazione delle LLPS nelle cellule vive è importante anche perché la condensazione aberrante è stata collegata a numerose malattie, tra cui tumori e disturbi neurodegenerativi. La LLPS è spesso guidata da interazioni selettive, transitorie e multivalenti tra proteine intrinsecamente disordinate. Di grande interesse sono le dinamiche di interazione delle proteine che partecipano alle LLPS, che sono ben riassunte dalle misurazioni del loro tempo di residenza di legame (RT), cioè la quantità di tempo che trascorrono legate all’interno dei condensati. Qui, presentiamo un metodo basato sull’imaging di singole molecole di cellule vive che ci consente di misurare la RT media di una specifica proteina all’interno dei condensati. Visualizziamo simultaneamente le singole molecole proteiche e i condensati a cui si associano, utilizziamo il tracciamento di singole particelle (SPT) per tracciare le traiettorie delle singole molecole e quindi adattiamo le traiettorie a un modello di legame proteina-gocciolina per estrarre l’RT medio della proteina. Infine, mostriamo risultati rappresentativi in cui questo metodo di imaging a singola molecola è stato applicato per confrontare gli RT medi di una proteina nei suoi condensati LLPS quando fusa e non fusa in un dominio oligomerizzante. Questo protocollo è ampiamente applicabile alla misurazione delle dinamiche di interazione di qualsiasi proteina che partecipa alle LLPS.
Un numero crescente di lavori suggerisce che i condensati biomolecolari svolgono un ruolo importante nell’organizzazione cellulare e in numerose funzioni cellulari, ad esempio la regolazione trascrizionale 1,2,3,4,5, la riparazione del danno al DNA 6,7,8, l’organizzazione della cromatina 9,10,11,12, il cromosoma X inattivazione 13,14,15 e segnalazione intracellulare 16,17,18. Inoltre, la disregolazione dei condensati biomolecolari è implicata in molte malattie, tra cui i tumori 19,20,21 e le malattie neurodegenerative 22,23,24,25,26. La formazione di condensa è spesso guidata da interazioni transienti, selettive e multivalenti proteina-proteina, proteina-acido nucleico o acido nucleico-acido nucleico27. In determinate condizioni, queste interazioni possono portare alla separazione di fase liquido-liquido (LLPS), una transizione di densità che arricchisce localmente biomolecole specifiche in goccioline prive di membrana. Tali interazioni multivalenti sono spesso mediate dalle regioni intrinsecamente disordinate (IDR) delle proteine 1,28,29. La caratterizzazione biofisica di queste interazioni a livello molecolare è fondamentale per la nostra comprensione di numerose funzioni cellulari sane e aberranti, data la pervasività dei condensati attraverso di esse. Sebbene le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza confocale, ad esempio il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP)30,31,32, siano state ampiamente utilizzate per dimostrare qualitativamente che gli scambi molecolari tra i condensati e l’ambiente cellulare circostante sono dinamici, quantificare le dinamiche di interazione di specifiche biomolecole all’interno dei condensati non è generalmente possibile utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a singola molecola microscopia senza metodi specializzati di analisi dei dati. La tecnica di tracciamento di singole particelle (SPT) descritta in questo protocollo si basa sulla microscopia a singola molecola di cellule vive33 e fornisce uno strumento straordinariamente potente per quantificare le dinamiche di interazione tra proteine specifiche all’interno dei condensati. La lettura dell’SPT per tale misurazione è il tempo medio di permanenza di una proteina di interesse nei condensati.
Il protocollo può essere suddiviso in due parti: acquisizione e analisi dei dati. Il primo passo dell’acquisizione dei dati di imaging è quello di esprimere nelle cellule una proteina di interesse che viene fusa con un HaloTag34. Ciò consente di marcare la proteina di interesse con due fluorofori, dove la maggior parte delle molecole proteiche devono essere marcate con un fluoroforo non fotoattivabile (ad esempio, JFX549 Halo ligando35) e una piccola frazione di esse deve essere marcata con un fluoroforo spettralmente distinto e fotoattivabile (ad esempio, PA-JF646 Halo ligando36). Ciò consente l’acquisizione simultanea di tutte le posizioni dei condensati nella cellula e l’acquisizione di film a singola molecola della proteina di interesse che si lega e si dislega ai condensati. Nel frattempo, lo stesso tipo di cellule viene modificato per esprimere stabilmente H2B con Halo-tagged, un istone che è in gran parte immobile sulla cromatina. Le cellule vengono quindi colorate con il ligando PA-JF646 Halo per consentire l’imaging di una singola molecola di H2B. Come verrà discusso in dettaglio in seguito, questo esperimento tiene conto del contributo del fotosbiancamento per consentire una quantificazione precisa delle dinamiche di interazione della proteina di interesse. Le cellule per gli esperimenti di imaging devono quindi essere coltivate su vetrini coprioggetti puliti, colorate con ligandi HaloTag e assemblate in una camera di imaging per cellule vive. Da lì, il campione viene ripreso sotto l’illuminazione di un foglio ottico altamente inclinato e laminato (HILO) su un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) in grado di eseguire l’imaging a due canali e il rilevamento di una singola molecola. L’emissione viene quindi suddivisa su due telecamere, una che traccia le posizioni del condensato e una che traccia le singole molecole. L’acquisizione viene eseguita con un lungo tempo di integrazione (dell’ordine di centinaia di ms) per offuscare le proteine che diffondono liberamente e catturare solo le proteine che sono meno mobili a causa del legame con strutture stabili nella cellula37.
Il primo passo dell’analisi dei dati consiste nell’utilizzare un algoritmo di tracciamento a singola particella (SPT)38,39 per localizzare le singole molecole proteiche in ogni fotogramma del filmato e assemblare le localizzazioni in una traiettoria per ciascuna molecola nel corso della sua vita rilevabile. Le traiettorie vengono quindi ordinate in quelle che rappresentano le molecole all’interno e quelle che rappresentano le molecole all’esterno dei condensati confrontando le localizzazioni delle molecole lungo le loro traiettorie con le localizzazioni di tutti i condensati nei tempi corrispondenti1.
Successivamente, viene generata una curva di sopravvivenza (1 – CDF) utilizzando le lunghezze di tutte le traiettorie in condensa. Il tempo medio apparente di permanenza delle molecole viene quindi estratto adattando la curva di sopravvivenza al seguente modello esponenziale a due componenti di legame proteico,
,
con A come frazione di molecole non specificamente legate e con kobs,ns e kobs,s come i tassi di dissociazione osservati delle molecole non specificamente legate e specificamente legate, rispettivamente. Da qui in poi vengono considerati solo kobs,s . La dinamica sia della dissociazione proteica, ktrue,s, che del fotosbiancamento del fluoroforo, kpb, contribuisce a kobs,s come
;
quindi, per isolare gli effetti della dissociazione proteica, viene misurato il tasso di dissociazione specifico di H2B-Halo nella linea cellulare menzionata in precedenza.
L’H2B è una proteina che è stabilmente integrata nella cromatina e che sperimenta una dissociazione minima nella scala temporale dell’acquisizione di un film a singola molecola37. Il suo tasso di dissociazione specifica è quindi uguale al tasso di fotosbiancamento del ligando PA-JF646 Halo, o
.
Il tempo medio di permanenza nel condensato della proteina di interesse, , è quindi
.
Vengono mostrati i risultati rappresentativi di Irgen-Gioro et al.40 , dove questo protocollo è stato applicato per dimostrare che la fusione di un dominio di oligomerizzazione con l’IDR si traduce in tempi di permanenza più lunghi dell’IDR nei suoi condensati. Questo risultato suggerisce che il dominio di oligomerizzazione aggiunto stabilizza le interazioni omotipiche dell’IDR che guida le LLPS. In linea di principio, lo stesso metodo con protocolli leggermente modificati può essere applicato per caratterizzare le interazioni omotipiche o eterotipiche di qualsiasi proteina che partecipi alla formazione di qualsiasi tipo di condensato.
Il protocollo qui presentato è progettato per sistemi come quelli studiati in Irgen-Gioro et al.40. A seconda dell’applicazione, alcuni componenti del protocollo possono essere modificati, ad esempio il metodo per generare linee cellulari marcate con fluorescenza, il sistema di marcatura fluorescente e lo stile di vetrino coprioggetto utilizzato. L’halo-tagging di una proteina in una cellula può essere fatto usando due strategie, a seconda di quale sia più adatta per un determinato esperimento….
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship nell’ambito della sovvenzione n. DGE-1745301 (S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award (S.C.), Searle Scholar Award (S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), Mallinckrodt Research Grant (S.C.) e Margaret E. Sovvenzione Early Medical Research Trust 2024 (S.C.). S.C. è anche supportato dal NIH/NCI con il numero di premio P30CA016042.
0.1 µm TetraSpeck microsphere | Invitrogen | T7279 | Single-molecule imaging |
25 mm Diameter, #1.5 Coverslips | Marienfeld Superior | 111650 | Preparation of coverslips |
593/40 nm bandpass filter | Semrock | FF01-593/40-25 | Single-molecule imaging |
676/37 nm bandpass filter | Semrock | FF01-676/37-25 | Single-molecule imaging |
6-Well TC Plate | Genesee | 25-105MP | Preparation of cells for microscopy |
Cell Line: U-2 OS | ATCC | HTB-96 | Labeling of proteins in cells |
ConvertASCII_SlowTracking_css3 .m |
Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
Coverglass Staining Rack | Thomas | 24957 | Preparation of coverslips |
Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549) | Janelia Research Campus | Preparation of cells for microscopy | |
DMEM, Low Glucose | Gibco | 10-567-022 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
Eclipse Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | Single-molecule imaging | |
Ethanol 200 Proof | Lab Alley | EAP200-1GAL | Preparation of coverslips |
evalSPT | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020 | ||
Fetal Bovine Serum | Cytiva | SH30396.03 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
Fiji | Analysis of single-molecule imaging data | ||
Ikon Ultra CCD Camera | Andor | X-13723 | Single-molecule imaging |
Longpass dichroic beamsplitter | Semrock | Di02-R635-25×36 | Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter |
LUN-F Laser Unit | Nikon | Single-molecule imaging: 405/488/561/640 | |
MatTek glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture. |
NIS-Elements | Nikon | Single-molecule imaging: Microscope acquisition software | |
nucleus and cluster mask_v2.txt | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15-140-122 | Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Labeling of proteins in cells |
Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646) | Janelia Research Campus | Preparation of cells for microscopy | |
PLOT_ResidenceHist_css.m | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
Potassium Hydroxide | Mallinckrodt Chemicals | 6984-06 | Preparation of coverslips |
pretracking_comb.txt | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018 | ||
SLIMfast | Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016 | ||
Stage-top incubation system | Tokai Hit | Single-molecule imaging: For live-cell imaging | |
TwinCam dual emission image splitter | Cairn Research | Single-molecule imaging | |
Ultrasonic Cleaner | Branson | 5800 | Preparation of coverslips |