Summary

Studio comparativo di matrici di membrana basale per il mantenimento di cellule staminali umane e la generazione di organoidi intestinali

Published: March 15, 2024
doi:

Summary

Gli organoidi sono diventati strumenti preziosi per la modellazione delle malattie. La matrice extracellulare (ECM) guida il destino cellulare durante la generazione degli organoidi e l’utilizzo di un sistema che assomiglia al tessuto nativo può migliorare l’accuratezza del modello. Questo studio confronta la generazione di organoidi intestinali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte in ECM di origine animale e idrogel privi di xeno.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo fondamentale nel comportamento e nello sviluppo cellulare. Gli organoidi generati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono sotto i riflettori di molte aree di ricerca. Tuttavia, la mancanza di segnali fisiologici nei materiali classici per colture cellulari ostacola un’efficiente differenziazione delle iPSC. L’integrazione della MEC disponibile in commercio nella coltura di cellule staminali fornisce spunti fisici e chimici utili per il mantenimento delle cellule. I prodotti di membrana basale di origine animale disponibili in commercio sono composti da proteine ECM e fattori di crescita che supportano il mantenimento cellulare. Poiché la ECM possiede proprietà tessuto-specifiche in grado di modulare il destino cellulare, le matrici prive di xeno vengono utilizzate per accelerare la traduzione verso gli studi clinici. Sebbene le matrici disponibili in commercio siano ampiamente utilizzate nel lavoro su hiPSC e organoidi, l’equivalenza di queste matrici non è stata ancora valutata. Qui, è stato condotto uno studio comparativo del mantenimento dell’hiPSC e della generazione di organoidi intestinali umani (hIO) in quattro diverse matrici: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Sebbene le colonie mancassero di una forma perfettamente rotonda, c’era una differenziazione spontanea minima, con oltre l’85% delle cellule che esprimevano il marcatore delle cellule staminali SSEA-4. La matrice 4-XF ha portato alla formazione di grumi rotondi 3D. Inoltre, l’aumento della concentrazione di integratori e fattori di crescita nei terreni utilizzati per produrre la soluzione di idrogel Matrix 4-XF ha migliorato l’espressione di SSEA-4 da parte di hiPSC di 1,3 volte. La differenziazione della hiPSC mantenuta con Matrix 2-AB ha portato a un minor numero di rilasci di sferoidi durante lo stadio medio/posteriore dell’intestino rispetto alle altre membrane basali di origine animale. Rispetto ad altre, la matrice di organoidi xeno-free (Matrix 4-O3) porta a hIO più grandi e più mature, suggerendo che le proprietà fisiche degli idrogel xeno-free possono essere sfruttate per ottimizzare la generazione di organoidi. Nel complesso, i risultati suggeriscono che le variazioni nella composizione di diverse matrici influenzano le fasi di differenziazione dell’IO. Questo studio aumenta la consapevolezza sulle differenze nelle matrici disponibili in commercio e fornisce una guida per l’ottimizzazione delle matrici durante il lavoro iPSC e IO.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) è un componente dinamico e multifunzionale dei tessuti che svolge un ruolo centrale nella regolazione del comportamento e dello sviluppo cellulare. Essendo una rete complessa, fornisce supporto strutturale, ligandi adesivi cellulari1 e immagazzinamento di fattori di crescita e citochine che regolano la segnalazione cellulare. Ad esempio, durante la guarigione delle ferite, la MEC funge da impalcatura per le cellule in migrazione e da serbatoio di fattori di crescita coinvolti nella riparazione dei tessuti2. Allo stesso modo, la disregolazione nella MEC può portare ad un aumento della gravità di varie malattie come la fibrosi e il cancro 3,4. Durante lo sviluppo embrionale, la MEC guida la morfogenesi dei tessuti. Ad esempio, nello sviluppo del cuore, i componenti della MEC svolgono un ruolo nella creazione della corretta architettura e funzione del tessuto cardiaco5. Oltre un decennio di ricerca ha dimostrato che la rigidità del microambienteda sola 6,7 può controllare la specifica del lignaggio delle cellule staminali. Pertanto, non sorprende che durante la differenziazione cellulare in vitro, la ECM influenzi il destino delle cellule staminali fornendo segnali per la differenziazione.

Gli organoidi possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Per generare con successo gli organoidi è necessario partire da una linea iPSC correttamente caratterizzata. Tuttavia, la mancanza di segnali fisiologici nei materiali classici per colture cellulari ostacola l’efficiente differenziazione delle iPSC e la generazione di organoidi. Inoltre, recenti ricerche hanno sottolineato l’importanza della composizione della matrice extracellulare (ECM), delle interazioni tra le cellule e la ECM8, nonché dei segnali meccanici e geometrici 9,10,11 nel contesto dell’espansione e del differenziamento degli organoidi12. L’avanzamento della tecnologia degli organoidi attraverso il miglioramento della riproducibilità comporterà l’incorporazione di segnali fisici e chimici specifici del tessuto.

Gli organoidi mirano a ricapitolare il tessuto nativo all’interno di un microambiente fisiologicamente simile. La scelta di un sistema ECM che imiti fedelmente l’ECM del tessuto nativo è fondamentale per ottenere una rilevanza fisiologica per quanto riguarda il comportamento, la funzione e la risposta delle cellule agli stimoli13. La scelta dei componenti della ECM può influenzare la differenziazione delle cellule staminali in tipi cellulari specifici all’interno dell’organoide. Diverse proteine della ECM e le loro combinazioni possono fornire indizi che guidano il destino cellulare14. Ad esempio, gli studi hanno dimostrato che l’utilizzo di componenti specifici della MEC può promuovere la differenziazione delle cellule staminali intestinali in tipi di cellule intestinali mature, dando vita a organoidi intestinali fisiologicamente rilevanti15. Sebbene gli organoidi siano uno strumento prezioso durante la modellazione delle malattie e i test farmacologici, la selezione di un sistema ECM appropriato è fondamentale per questa applicazione. Un sistema ECM appropriato può migliorare l’accuratezza della modellazione della malattia creando un microambiente che assomiglia al tessuto interessato16. Inoltre, la MEC tessuto-specifica può aiutare a generare organoidi che ricapitolano meglio i fenotipi associati alla malattia e le risposte ai farmaci17. L’ottimizzazione del sistema ECM utilizzato nella differenziazione degli organoidi è fondamentale per ottenere i risultati di differenziazione desiderati.

I sistemi di membrane basali disponibili in commercio derivati da fonti animali di ECM (ad esempio, Matrigel, Cultrex) e idrogel privo di xeno (ad esempio, VitroGel) sono ampiamente utilizzati nella ricerca su iPSC e organoidi. Le aziende che li commercializzano e i ricercatori che li utilizzano hanno elaborato molte istruzioni per i loro prodotti e applicazioni specifici nel corso degli anni. Molte di queste istruzioni sono servite come guida per la generazione di questo protocollo. Inoltre, i benefici e le battute d’arresto associati alle loro proprietà intrinseche sono stati notati individualmente da molti 18,19,20,21. Tuttavia, non esiste un flusso di lavoro sistematico che guidi la selezione dei sistemi ottimali per il lavoro con iPSC e organoidi. In questo caso, viene fornito un flusso di lavoro per valutare sistematicamente l’equivalenza dei sistemi ECM provenienti da varie fonti per il lavoro con iPSC e organoidi. Questo è uno studio comparativo del mantenimento di due diverse linee di iPSC umane (hiPSC) e della generazione di organoidi intestinali umani (hIO) in quattro diverse matrici: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Per la coltura di organoidi, sono state utilizzate quattro versioni di VitroGel a matrice priva di xeno precedentemente ottimizzate per la coltura di organoidi: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Inoltre, sono state utilizzate matrici di origine animale ottimizzate per organoidi: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) e Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Sono stati utilizzati terreni di coltura di cellule staminali disponibili in commercio (mTeSR Plus) e kit di differenziazione degli organoidi (STEMdiff intestinal organoid kit). Questo protocollo combina le istruzioni individuali dei produttori dei prodotti con le esperienze di laboratorio per guidare il lettore verso un’ottimizzazione di successo dell’ECM per il loro specifico lavoro iPSC e organoide. Nel complesso, questo protocollo e i risultati rappresentativi sottolineano l’importanza di selezionare il microambiente ottimale per il lavoro sulle cellule staminali e la differenziazione degli organoidi.

Protocol

1. Manutenzione hiPSC ATTENZIONE: Tutto il lavoro viene svolto in una cabina di biosicurezza (BSC) seguendo tecniche asettiche standard. Deve seguire gli standard di sicurezza OSHA per i laboratori, incluso l’uso corretto di dispositivi di protezione individuale come camici da laboratorio, guanti e occhiali. Preparazione di matrici, aliquote e terreni di coltura cellularePer membrane basali di derivazione animale (BMs; Matrice 1-AB, Matrice 2-AB, Matrice 3-AB…

Representative Results

Seguendo questo protocollo, le membrane basali disponibili in commercio e un sistema di idrogel privo di xeno sono stati utilizzati con successo per coltivare cellule hiPSC e differenziarle in hIO. L’obiettivo principale di questi esperimenti era quello di valutare sistematicamente l’equivalenza di matrici provenienti da varie fonti per il lavoro su hiPSC e hIO. La prima sezione di questo protocollo si è concentrata sul mantenimento e la caratterizzazione di una coltura sana di iPSC che produca un’efficiente generazione…

Discussion

La selezione del microambiente ottimale per il lavoro con cellule staminali e organoidi è un primo passo fondamentale quando si utilizzano queste piattaforme per un’ampia gamma di applicazioni. I nostri risultati rappresentativi mostrano che la matrice 4-XFO3, in combinazione con una maggiore concentrazione di fattori di crescita, porta a organoidi più grandi, suggerendo che le proprietà fisiche degli idrogel privi di xeno possono essere sfruttate per ottimizzare la generazione di organoidi utilizzando questi sistemi….

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono la formazione precedente e le raccomandazioni generali riguardanti l’inizio del lavoro su hiPSC e organoidi da parte dei dottori Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano e Russell D’Souza. Ringraziano la dottoressa Chelsey Simmons per la sua guida nell’utilizzo dei sistemi di idrogel per il lavoro di coltura cellulare in vitro . Inoltre, gli autori desiderano ringraziare i dottori Christine Rodriguez e Thomas Allison di STEMCELL Technologies per la loro guida sulla coltura hiPSC. Gli autori ringraziano anche TheWell Bioscience per aver coperto i costi di pubblicazione.

Materials

24-Well Plate (Culture treated, sterile) Falcon 353504
37 °C water bath VWR
96-well plate  Fisher Scientific FB012931
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634
Anti-adherence Rinsing Solutio STEMCELL Technologies 7010
Biological safety cabinet (BSC) Labconco  Logic
Brightfield Microscope Echo Rebel REB-01-E2
BXS0116 ATCC ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities) ThermoScientific 75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339650
Conical tubes, 50 mL, sterile Thermo Fisher Scientific 339652
Cultrex RGF BME, Type 2 Bio-techne 3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME  Bio-techne 3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) Thermo Fisher Scientific 14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor Gibco  A14133-02
GlutaMAX Supplement Thermo Fischer Scientific 35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional) Luminex 0500-3115
HEPES buffer solution Thermo Fischer Scientific 15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) Thermo Scientific  51033775
JMP Software SAS Institute JMP 16
MATLAB MathWorks, Inc R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free Corning  356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free Corning  354263
mTeSR Plus Medium STEMCELL Technologies 100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate Thermo Scientific 144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM) BD Pharmingen 566841
PE Mouse Anti-human CDX2  BD Pharmingen 563428
PE Mouse Anti-human FOXA2 BD Pharmingen 561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4  BD Pharmingen 561565
ReLeSR STEMCELL 5872
SCTi003-A STEMCELL Technologies 200-0510
Serological pipettes (10 mL)  Fisher Scientific 13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)  Fisher Scientific 13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium STEMCELL Technologies 5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit STEMCELL Technologies 5140
Vitrogel Hydrogel Matrix TheWell Bioscience VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit TheWell Bioscience VHM04-K

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Pineiro-Llanes, J., da Silva, L., Huang, J., Cristofoletti, R. Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation. J. Vis. Exp. (205), e66277, doi:10.3791/66277 (2024).

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