I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l’organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l’uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.
La maggior parte degli organismi viventi possiede ritmi circadiani, che sono processi biologici che si verificano entro un periodo di circa 24 ore e regolano un repertorio diversificato di processi cellulari e fisiologici che vanno dai cicli sonno-veglia al metabolismo. Questo meccanismo dell’orologio trascina l’organismo in base ai cambiamenti ambientali e coordina la regolazione temporale degli eventi molecolari e fisiologici. In precedenza, è stato dimostrato che i ritmi circadiani autonomi vengono mantenuti anche a livello di singola cellula utilizzando linee cellulari come i fibroblasti NIH3T3, che sono stati determinanti per scoprire i meccanismi dei ritmi circadiani. Tuttavia, queste linee cellulari sono colture omogenee prive di multicellularità e di robuste comunicazioni intercellulari. Nell’ultimo decennio, è stato svolto un ampio lavoro sullo sviluppo, la caratterizzazione e l’applicazione di organoidi 3D, che sono sistemi multicellulari in vitro che assomigliano a strutture e funzioni morfologiche in vivo . Questo articolo descrive un protocollo per rilevare i ritmi circadiani utilizzando un reporter bioluminescente negli enteroidi intestinali umani, che consente lo studio dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro.
Orologio circadiano
Tutti gli organismi, dai batteri ai mammiferi, hanno una relazione complessa e dinamica con il loro ambiente. All’interno di questa relazione, l’adattamento ai cambiamenti ambientali è fondamentale per la sopravvivenza degli organismi. La maggior parte degli organismi possiede ritmi circadiani che consentono loro di adattarsi e ottimizzare le proprie funzioni a cicli diurni di circa 24 ore. L’orologio circadiano è una rete gerarchica di orologi centrali e periferici che lavorano in cooperazione per mantenere l’omeostasi fisiologica e mantenere gli organismi sincronizzati con i cambiamenti giornalieri 1,2. Nei mammiferi, l’orologio centrale o master situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN) riceve segnali esterni, come la luce, e trasmette le informazioni agli orologi periferici attraverso un’interazione avanzata di vie di segnalazione neurali e umorali3. Oltre all’orologio centrale, i tessuti periferici possiedono un proprio meccanismo di orologio circadiano autonomo dalle cellule, mantenuto da un ciclo di feedback negativo trascrizionale-traduzionale (TTFL) che regola i geni controllati dall’orologio tessuto-specifici (CCGs)4,5. Questo macchinario molecolare produce una ritmicità di circa 24 ore in eventi cellulari e fisiologici, come espressioni geniche, vie di segnalazione, risposte immunitarie e digestione. L’orologio circadiano è presente in quasi tutte le cellule di mammifero ed è stato dimostrato che fino al 50% dei modelli di espressione dei geni mostra una ritmicità circadiana6. Considerando l’abbondanza di CCG, l’interruzione di questo meccanismo di clock può causare problemi fisiologici critici. Pertanto, le indagini sui ritmi circadiani sono necessarie per chiarire i meccanismi biologici essenziali e sviluppare nuove strategie terapeutiche.
Sistema reporter luciferasi
Negli studi circadiani, il monitoraggio in tempo reale è fondamentale per una migliore comprensione dei comportamenti e delle risposte cellulari perché consente di tracciare i cambiamenti temporali nell’espressione genica e/o nei livelli proteici, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari regolati dall’orologio circadiano. Inoltre, il monitoraggio in tempo reale consente ai ricercatori di studiare gli effetti dei cambiamenti ambientali sui meccanismi molecolari 7,8. Esistono numerose tecniche per gli studi di monitoraggio in tempo reale, tra cui il saggio di bioluminescenza, ampiamente utilizzato per monitorare l’espressione genica o i livelli di proteine nel tempo. Il saggio di bioluminescenza è un metodo per rilevare i processi biologici utilizzando la produzione di luce come lettura. In questo saggio, un enzima ossidativo che produce bioluminescenza (ad esempio, luciferasi) viene trasfettato transitoriamente o stabilmente nelle cellule di interesse e la lettura della bioluminescenza viene misurata in presenza di un substrato (ad esempio, luciferina) nel tempo. Ad esempio, l’enzima luciferasi produce bioluminescenza ossidando il substrato luciferina in presenza di ATP9. Grazie alla sua breve emivita, 3-4 oree 10 ore, la luciferasi delle lucciole è uno strumento potente per gli studi circadiani in termini di monitoraggio dinamico in tempo reale con rumore di fondo minimo 11,12,13. Per l’inserimento di DNA con un promotore marcato con luciferasi o un telaio di lettura aperto (ORF), il sistema di consegna genica lentivirale è un metodo affidabile che fornisce un’elevata efficacia di trasduzione, un’integrazione stabile e una bassa immunogenicità. La trasduzione stabile di un reporter bioluminescente fornisce un’espressione robusta nelle cellule in divisione e non in divisione, generando dati coerenti per gli studi circadiani14.
Organoide come modello
Le tradizionali linee cellulari bidimensionali immortalizzate sono state determinanti in studi biologici che vanno dalla scoperta dei meccanismi molecolari fondamentali dei ritmi circadiani allo screening dei farmaci. Nonostante la convenienza dell’utilizzo di linee cellulari omogeneizzate, mancano di strutture multicellulari e interazioni intercellulari. Al contrario, gli organoidi sono strutture multicellulari “organiche” 3D in vitro che imitano la struttura degli organi in un piatto mostrando somiglianza con l’architettura dei tessuti in vivo e la multicellularità, inclusi i tipi di cellule staminali, progenitrici e differenziate15,16. Il possesso di caratteristiche di auto-organizzazione, multicellularità e funzionalità rende gli organoidi un notevole modello in vitro che rappresenta i processi cellulari e fisiologici che avvengono nei tessuti reali17. Diversi tipi di organoidi possono essere derivati da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretta o cellule staminali adulte raccolte da vari organi, tra cui l’intestino tenue, il cervello, il fegato, il polmone e il rene18,19. Poiché le strutture degli organoidi possiedono un’architettura e una funzione simile a quella dei tessuti con la multicellularità e l’interazione dinamica cellula-cellula, sono superiori alle linee cellulari omogeneizzate per comprendere gli eventi cellulari che si verificano nei tessuti in vivo. Gli organoidi sono anche facilmente manipolabili e possono essere coltivati in condizioni controllate, il che li rende utili per gli studi circadiani20.
Lo scopo principale di questo lavoro è quello di introdurre un metodo di monitoraggio in tempo reale utilizzando un saggio di bioluminescenza specificamente studiato per lo studio dei ritmi circadiani in organoidi 3D multicellulari. Il monitoraggio in tempo reale degli eventi cellulari utilizzando una tecnica di saggio di bioluminescenza è stato ampiamente eseguito per colture cellulari prive della complessità multicellulare e delle comunicazioni intercellulari esistenti nei tessuti reali. Gli organoidi 3D offrono opportunità uniche per studiare le funzioni dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro. Ad esempio, si potrebbero studiare i ritmi circadiani negli organoidi con composizioni cellulari alterate o organoidi derivati da tessuti malati dei pazienti. Questo protocollo consente l’utilizzo di un saggio di bioluminescenza per studiare diversi aspetti dei ritmi circadiani in un modello in vitro fisiologicamente più rilevante, gli organoidi, che ci aiuterà a comprendere meglio i ruoli dei ritmi circadiani negli organi periferici.
Il saggio di bioluminescenza offre diversi vantaggi per lo studio dei ritmi circadiani, che richiede la raccolta di dati da esperimenti a lungo termine. In primo luogo, consente ai ricercatori di monitorare l’espressione genica o la proteina di interesse mentre le cellule si muovono e proliferano. Senza apportare modifiche inutili o interrompere le funzioni delle cellule, gli eventi cellulari interessati o l’espressione genica possono essere registrati utilizzando la lettura della bioluminescenza, che fornisce dati affid…
The authors have nothing to disclose.
Gli enteroidi intestinali umani sono stati ottenuti dal laboratorio del Dr. Michael Helmrath presso il Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC). Questo lavoro è stato supportato da R01 DK11005 (CIH) e dal finanziamento pilota del Cancer Center dell’Università di Cincinnati. Siamo grati per il supporto all’imaging da parte del Live Microscopy Core (NIH S10OD030402) dell’Università di Cincinnati.
35 x 10 Falcon tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | |
A 83-01 | Sigma Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-028 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-829-1Bb | Mfrn: BD 329424 |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | GSK-3 inhibitor |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902-500MG | |
D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | |
Gastrin I Human | Sigma Aldrich | G9020 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel | Corning | CB-40230C | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stemcell Technologies | 06010 | Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium |
Kronos Dio Luminometer Machine | ATTO Corporation | AB-2550 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165 | |
pABpuro-BluF reporter plasmid | Addgene | 46824 | |
PBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Recombinant murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
Y-27632 | R&D Systems | 1254/10 | ROCK inhibitor |