Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito
Summary
Le interazioni delle biomolecole, come le interazioni proteina-proteina, sono la base molecolare delle funzioni biologiche. Se i mutanti con interazione nulla/alterata che mancano specificamente dell’interazione rilevante possono essere isolati, saranno di grande aiuto per comprendere le funzioni di questa interazione. Questo articolo presenta un modo efficiente per isolare i mutanti con interazione, null/impromesse.
Abstract
Le interazioni proteina-proteina sono uno dei processi più basilari che sono alla base dei fenomeni biologici. Uno dei modi più semplici e migliori per comprendere i ruoli e le funzioni di una specifica interazione proteina-proteina è confrontare il fenotipo del wild-type (con la relativa interazione proteina-proteina) e quelli dei mutanti che non hanno la relativa interazione. Pertanto, se tali mutanti possono essere isolati, aiuteranno a chiarire i processi biologici correlati. La procedura a due ibridi di lievito (Y2H) è un approccio potente non solo per rilevare le interazioni proteina-proteina, ma anche per isolare mutanti nulli/alterati dall’interazione. In questo articolo, viene presentato un protocollo per isolare mutanti con interazione/alterazione utilizzando la tecnologia Y2H. In primo luogo, viene costruita una libreria di mutazioni combinando la reazione a catena della polimerasi e un’efficiente tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità, che esclude in modo efficiente il vettore vuoto dalla libreria. In secondo luogo, i mutanti con interazione nulla/alterata vengono sottoposti a screening mediante il saggio Y2H. A causa di un trucco nel vettore Y2H, i mutanti indesiderati, come quelli con mutazioni frameshift e nonsenso, vengono eliminati in modo efficiente dal processo di screening. Questa strategia è semplice e può quindi essere applicata a qualsiasi combinazione di proteine la cui interazione può essere rilevata dal sistema a due ibridi.
Introduction
Le interazioni tra biomolecole sono la parte più basilare dei fenomeni biologici. Le interazioni proteina-proteina costituiscono una parte significativa di tali interazioni. Pertanto, l’identificazione dei partner di interazione di una proteina di interesse è fondamentale per chiarire ulteriormente la funzione della proteina/gene di interesse. Il metodo a due ibridi di lievito (Y2H) è una tecnica popolare per identificare le interazioni proteina-proteina in vivo1. In questo sistema, due proteine (X e Y) la cui interazione deve essere testata sono fuse rispettivamente al dominio di legame del DNA (DB) e al dominio di attivazione trascrizionale (AD). La proteina di fusione DB-X si lega a una sequenza di riconoscimento del dominio DB; quindi, quando le proteine X e Y interagiscono, la proteina di fusione AD-Y si trova in prossimità della sequenza di riconoscimento. Di conseguenza, viene attivata la trascrizione del gene reporter a valle della sequenza di riconoscimento. Pertanto, la presenza o l’assenza di attività del gene reporter può essere utilizzata per determinare la presenza o l’assenza dell’interazione proteina-proteina1.
Una volta identificato uno specifico partner di interazione della proteina di interesse, dovrebbero essere eseguite ulteriori analisi per chiarire la funzione biologica dell’interazione. A questo scopo, se i mutanti delle proteine che compromettono o rimuovono l’interazione proteina-proteina specifica possono essere isolati, serviranno come potenti strumenti. Il sistema Y2H può essere utilizzato direttamente per isolare tali mutanti mediante lo screening di cloni “negativi all’interazione”, a partire dal clone “positivo all’interazione” di tipo selvatico. Per accelerare questo processo, sono stati sviluppati sistemi Y2H “inversi” (rY2H) 2,3. Nei sistemi rY2H, i ceppi di lievito ospite ospitano geni marcatori contro-selezionabili come geni reporter, il che significa che le cellule di lievito crescono solo quando le proteine AD-Y e DB-X non interagiscono.
Sebbene entrambi i sistemi Y2H e rY2H permettano l’isolamento di mutanti negativi all’interazione, il processo di isolamento dei mutanti è laborioso perché non tutti i candidati ottenuti dallo screening portano il tipo di mutazioni desiderato (di solito mutazioni missenso). Il problema più serio è che una frazione significativa di candidati presenta mutazioni frameshift o nonsenso, ed è necessario eseguire il western blotting per escludere cloni indesiderati. Per ovviare a questo problema, sono stati sviluppati nuovi vettori plasmidici4. In questi vettori, KanMX, un marcatore di resistenza ai farmaci, è posizionato fuori dal fotogramma a valle del dominio DB o AD. Il gene marcatore diventa in-frame con il dominio DB o AD solo quando viene inserito il gene di interesse. Quando una o più mutazioni casuali vengono introdotte nel gene di interesse, i mutanti indesiderati, come quelli con mutazioni frameshift o nonsenso, possono essere facilmente eliminati eseguendo la selezione della resistenza ai farmaci e i candidati portatori di mutazioni missenso desiderabili possono essere facilmente identificati con lo screening Y2H4. Questo articolo presenta un protocollo per isolare mutanti con interazione/alterazione di una proteina di interesse utilizzando questa strategia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive come isolare mutanti con interazione/alterati utilizzando il saggio Y2H. Tali mutanti sono potenti strumenti per analizzare la funzione di una proteina di interesse. Per isolare tali mutanti, i saggi rY2H sono stati sviluppati in precedenza modificando il ceppo ospiteY2H 2,3. Tuttavia, non hanno ridotto notevolmente la quantità di manodopera. Al contrario, i mutanti possono essere isolati con questo metodo senza una quantità significati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y. Tanaka ha eseguito il miglioramento tecnico di Y2H. Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione JSPS KAKENHI numero JP22K06336 e dall’Istituto per la fermentazione di Osaka.
Materials
| 0.5 M EDTA (8.0) | Nacalai Tesque Inc. | 14347-21 | |
| 10% SDS Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 313-90275 | |
| 2-mercaptoethanol | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 135-07522 | |
| 2-propanol | Kishida Chemical Co. Ltd. | 110-64785 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 021-07852 | |
| Agar | Formedium | AGR60 | |
| Ampicillin Sodium | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 68-52-3 | |
| Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT | Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. | M180-7 | |
| DNA from salmon testes | Merck KGaA. | D1626 | |
| Ethanol | Merck KGaA. | 9-0770-4-4L-J | |
| Filter paper for colony lift (Grade 50) | Whatman, Cytiva | 1450-090 | |
| Filter paper for colony lift (No.4A) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 01411090 | |
| Filter paper for replicaplating (No.1) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 00011150 | |
| G-418 Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 075-05962 | |
| Hydrochloric acid | Kishida Chemical Co. Ltd. | 230-37585 | |
| KCl | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 163-03545 | |
| Lithium Acetate Dihydrate | Nacalai Tesque Inc. | 20604-22 | |
| MgSO4•7H2O | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 131-00405 | |
| Na2HPO4•12H2O | Nacalai Tesque Inc. | 10039-32-4 | |
| NaCl | Nacalai Tesque Inc. | 31319-45 | |
| NaH2PO4•2H2O | Nacalai Tesque Inc. | 31717-25 | |
| Paper towel | AS ONE Corp. | 7-6200-02 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Nacalai Tesque Inc. | 25970-56 | |
| Plasmid DNAs | the National BioResource Project – yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml) | ||
| Plasmid isolation Kit | Nippon Genetics Co. Ltd. | FG-90502 | |
| Polyethylene Glycol #4,000 | Nacalai Tesque Inc. | 11574-15 | |
| SC double drop-out mix -Leu -Trp | Formedium | DSCK172 | |
| Seamless cloning kit (In-Fusion assembly ) | Takara Bio Inc. | #639648 | |
| Skim milk powder | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 190-12865 | |
| Streptomycin Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 3810-74-0 | |
| Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes) | Promega Corp. | M7122 | |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethane | Formedium | TRIS01 | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque Inc. | 12967-45 | |
| Tryptone | ThermoFisher scientific Inc. | 211705 | |
| Tween 20 | Nacalai Tesque Inc. | 35624-15 | |
| Yeast Extract | ThermoFisher scientific Inc. | 212750 | |
| Yeast Nitrogen Base (YNB) | Formedium | CYN0210 | |
| Zymolyase 100T | Nacalai Tesque Inc. | 07665-55 |
Riferimenti
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