Summary

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

Published: March 29, 2024
doi:

Summary

Viene descritto un nuovo metodo di iniezione intraperitoneale (IP) nel pesce zebra adulto. Quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, questa procedura è più efficace dei due metodi IP precedentemente riportati. La tecnica è progettata per essere facilmente adottata da ricercatori con esperienza limitata nel modello del pesce zebra.

Abstract

Il pesce zebra adulto (Danio rerio), che è geneticamente accessibile, viene impiegato come prezioso modello di vertebrato per studiare disturbi umani come la cardiomiopatia. L’iniezione intraperitoneale (IP) è un metodo importante che fornisce composti all’organismo per testare gli effetti terapeutici o generare modelli di malattia come la cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC). Attualmente, esistono due metodi di iniezione IP. Entrambi i metodi hanno limitazioni quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, che provocano effetti collaterali che si manifestano come gravi danni alla forma del corpo e morte dei pesci. Sebbene queste carenze possano essere superate con un’ampia formazione degli investigatori, è auspicabile un nuovo metodo di iniezione IP che abbia effetti collaterali minimi. In questo caso, viene riportato un metodo di iniezione IP unico in grado di gestire composti tossici. Una funzione cardiaca costantemente ridotta può risultare senza incorrere in una morte significativa dei pesci. La tecnica può essere facilmente padroneggiata dai ricercatori che hanno un’esperienza minima con il pesce zebra adulto.

Introduction

Il pesce zebra (Danio rerio) ha guadagnato attenzione come modello sperimentale per lo studio delle malattie umane perché questo animale comprende un’elevata omologia genica e di organi con l’uomo, fecondazione esterna, facilità di manipolazione genetica e trasparenza del corpo nella prima maturità, che facilita una miriade di applicazioni di imaging1. A differenza del semplice processo di somministrazione di farmaci direttamente in acqua per embrioni e larve di pesce zebra, la somministrazione di farmaci a pesci zebra adulti presenta un’impresa più complessa e impegnativa2.

Nei pesci adulti, i composti possono essere somministrati attraverso tecniche di somministrazione passiva di farmaci, come la somministrazione diretta in acqua, o attraverso metodi di somministrazione orale di farmaci come il gavaging2. Altri approcci includono il rivestimento del mangime per pesci con i composti e la successiva alimentazione del pesce3 e la somministrazione diretta di farmaci insolubili in acqua a una concentrazione predeterminata, comprese le iniezioni retro-orbitali o intraperitoneali 4,5. La somministrazione intraperitoneale è preferita per gli studi in vivo di modelli di malattia grazie ai suoi distinti vantaggi farmacocinetici6. Questo metodo fornisce un’elevata concentrazione di farmaco e un’emivita prolungata all’interno della cavità peritoneale, offrendo un percorso efficace per la somministrazione del farmaco 7,8. L’approccio è comunemente utilizzato in contesti di ricerca per garantire un assorbimento e una distribuzione ottimali dei farmaci 9. Mentre i metodi basati sull’iniezione si dimostrano efficaci per la somministrazione singola, le iniezioni prolungate e ripetute spesso portano a danni al corpo e infezioni croniche2.

Attualmente, ci sono due metodi di iniezione IP nello zerbafish adulto 4,10. Tuttavia, entrambi i metodi hanno dei limiti nella somministrazione di composti tossici come la doxorubicina, che portano a gravi danni alla forma del corpo e alla mortalità dei pesci. Gli effetti collaterali possono complicare notevolmente l’interpretazione dei dati. Sebbene queste sfide possano essere affrontate con una formazione approfondita10, c’è una chiara necessità di un nuovo metodo di iniezione IP che riduca al minimo gli effetti collaterali.

In questo caso, il nostro obiettivo è quello di sviluppare un nuovo metodo di iniezione IP ottimizzato per l’efficace somministrazione di doxorubicina in zebrafish adulto, facilitando la generazione di modelli affidabili di cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC) con danni corporei ridotti al minimo e mortalità associata.

Protocol

Tutte le procedure condotte sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali della Mayo Clinic, aderendo agli standard delineati nella “Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio” (National Academies Press, 2011). Tutti i pesci zebra nello studio appartengono al ceppo Wild Indian Karyotype (WIK). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali. 1. Preparazione e c…

Representative Results

In precedenza, sono state impiegate due metodiche intraperitoneali (IP) per la somministrazione di doxorubicina in zebrafish adulti 4,10. Nel metodo I, noto anche come metodo di iniezione IP classico come descritto da Kinkel et al.4, l’ago è stato inserito con un angolo di 45° rispetto alla linea mediana tra le pinne pelviche con l’addome rivolto verso l’alto. Nel metodo II, o metodo di iniezione IP alternativo come descritto da Ma et <s…

Discussion

A differenza dei due metodi di iniezione IP esistenti 4,10, il nuovo metodo di iniezione IP è caratterizzato dalle seguenti caratteristiche distintive. In primo luogo, viene utilizzato un angolo di penetrazione dell’ago unico (vicino allo zero); in secondo luogo, l’ago penetra nel pesce attraverso una posizione unica, cioè un foro naturale sulla superficie ventrale di un pesce, che faciliterebbe l’iniezione; e infine, il movimento dell’ago è da anteri…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal NIH (HL107304 e HL081753) e dalla Mayo Foundation (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) a XX. JL è finanziato dai fondi di ricerca fondamentale per le università centrali della Central South University, n. 56021702. Un ringraziamento speciale a Beninio Gore e Quentin Stevens per aver gestito l’impianto di zebrafish.

Materials

10 μL NanoFil-syringe World Precision Instruments, Inc NANOFIL injection tool
34 G needle World Precision Instruments, Inc NI34BV-2 injcetion tool
60 mm Petri dish fisher scientific/fisherbrand FB0875713A placing the sponge 
Dissecting microscope Nikon SMZ800 Injceting the Dox
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG drug for creating DIC model 
Echocardiography VISUAL SONICS Vevo 3100 measuring cardiac function
Foam Sponge Jaece Industries L800-D placing the fish
Hank's balanced salt solution (HBBS) Thermo Fisher 14025076 Vehicle for Dox
Microcentrifuge  southernlabware MyFuge/C1012 collect the Dox solution 
Precision Balance Scale Torbal AD60 Digital scales
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
Tube Eppendorf 1.5 mL storage 
vevo LAB  software FUJIFILM VISUAL SONICS  5.6.0 quantification of the heart

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Moossavi, M., Zhang, H., Li, J., Yan, F., Xu, X. An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality. J. Vis. Exp. (205), e66500, doi:10.3791/66500 (2024).

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