Qui, presentiamo un protocollo per l’imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.
Le complicanze dopo il trapianto di polmone sono in gran parte correlate alla risposta del sistema immunitario dell’ospite al trapianto. Tali risposte immunitarie sono regolate dal crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi. Una migliore comprensione di questi processi si basa sull’uso di modelli animali preclinici ed è aiutata dalla capacità di studiare il traffico di cellule immunitarie all’interno del trapianto in tempo reale. La microscopia intravitale a due fotoni può essere utilizzata per l’imaging di tessuti e organi per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotodanno minimo, il che offre un grande vantaggio rispetto alla microscopia confocale a singolo fotone. L’uso selettivo di topi transgenici con espressione proteica fluorescente promotore-specifica e/o il trasferimento adottivo di cellule marcate con colorante fluorescente durante la microscopia intravitale a due fotoni consente lo studio dinamico di singole cellule all’interno del loro ambiente fisiologico. Il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica per stabilizzare i polmoni di topo, che ci ha permesso di visualizzare le dinamiche cellulari nei polmoni naïve e negli innesti polmonari trapiantati ortotopicamente. Questa tecnica consente una valutazione dettagliata del comportamento cellulare all’interno del sistema vascolare e nell’interstizio, nonché l’esame delle interazioni tra le varie popolazioni cellulari. Questa procedura può essere facilmente appresa e adattata per studiare i meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie e tollerogeniche dopo il trapianto di polmone. Può anche essere esteso allo studio di altre condizioni polmonari patogene.
Il trapianto di polmone è l’opzione finale per molti pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale; Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di polmone è scarsa rispetto ad altri trapianti di organi solidi. La sopravvivenza a 5 anni è solo ~60%-70%1, rispetto all’80%-90% nei cuori2 e all’85%-90% nei reni3. Molte complicanze dopo il trapianto di polmone, come la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto mediato da anticorpi e la disfunzione cronica dell’allotrapianto polmonare, sono dovute alla risposta immunitaria dell’ospite all’allotrapianto. Ad esempio, il nostro gruppo ha dimostrato che i neutrofili vengono rapidamente reclutati nell’allotrapianto polmonare a seguito di danno da ischemia-riperfusione indotta dal trapianto e formano cluster dinamici che circondano i monociti del sangue4. Il crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi è responsabile delle risposte alloimmunitarie deleterie 5,6,7 e la capacità di studiare queste interazioni cellulari dinamiche in un modello animale vivo è inestimabile.
La microscopia a due fotoni consente l’imaging intravitale ad alta risoluzione per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotosbiancamento minimo dei tessuti 8,9. Viene utilizzato in una varietà di tessuti e siti anatomici, tra cui la neocorteccia10,11, la pelle12,13 e il rene 14,15. Più recentemente, è stato adattato a organi non statici come il polmone e il cuore 4,16,17. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l’imaging di innesti polmonari stabilizzati, ventilati e perfusi dopo trapianto di polmone sinistro ortotopico murino. Un vantaggio chiave del modello di trapianto è la capacità di manipolare geneticamente il donatore e il ricevente separatamente. Le singole popolazioni cellulari possono essere visualizzate con ceppi di topi transgenici con espressione proteica fluorescente knock-in, trasferimento adottivo di cellule marcate con fluorescenza5 o iniezione endovenosa di anticorpi marcati con fluorescenza per legare marcatori specifici della cellula 4,16,17,18.
Al fine di stabilizzare il polmone durante l’imaging, questo protocollo prevede l’incollaggio del polmone a un vetrino di copertura, mentre altri gruppi hanno descritto la stabilizzazione dell’aspirazione utilizzando un dispositivo di vuoto reversibile su misura19. Il nostro protocollo presenta diversi vantaggi, tra cui un’area di imaging più ampia e una relativa facilità di configurazione utilizzando materiali comunemente disponibili in un laboratorio di microscopia (inclusi vetrino coprioggetto e colla). Poiché questa tecnica di incollaggio vincola il polmone sulla superficie superiore, si prevede che riduca il movimento ventilatorio e consenta un imaging più profondo. Questa tecnica di imaging intravitale consente un’osservazione dettagliata del comportamento e delle interazioni delle cellule immunitarie in tempo reale, contribuendo allo studio dei meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie rispetto a quelle tollerogeniche dopo il trapianto di polmone.
L’eccitazione a due fotoni è stata descritta per la prima volta nella sua tesi di dottorato da Maria Göppert-Mayer nel 1931, che in seguito vinse il premio Nobel per la fisica per aver descritto la struttura del guscio nucleare22,23. La microscopia a fluorescenza tradizionale si basa sull’eccitazione di un singolo fotone, con lunghezze d’onda di eccitazione più corte e più elevate rispetto alle lunghezze d’onda di emissione. …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni del NIH 1P01AI11650 e della Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Ringraziamo l’In Vivo Imaging Core della Washington University School of Medicine.
0.75% povidone-iodine | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To secure mouse in position |
20x water immersion long objective lens | Olympus | N20X-PFH | |
3M Vetbond glue | Medi-Vet.com | 10872 | To glue coverglass to lung |
655 nm non-targeted quantum dots | ThermoFisher | Q21021MP | For labeling of blood vessels |
70% ethanol | Sigma Aldrich | EX0281 | For disinfectant |
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | |
Black O ring (2 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Bolt (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Brass thumb nut (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser | Coherent | N/A | |
Cover glass (24 mm x 50 mm) | Thomas Scientific | 1202F63 | For custom-built imaging chamber |
Curved mosquito clamp (1) | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Dual channel heater controller | Warner Instruments | TC-344B | |
Fine scissors (1) | Fine Science Tools | 15040-11 | |
Fixed-stage upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm) | McKesson | 476709 | To place under left lung |
High vacuum grease | Dow Corning | N/A | To adhere coverglass onto top plate |
Isoflurane 1% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
Metal sheet (3 cm x 7 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | |
Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
Straight forceps (1) | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Three channel shutter driver | Uniblitz | VMM-D3 | Resonant scanner |
x.y.z optical stepper motor | Prior Scientific | OptiScan II | |
Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |