Summary

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Published: April 19, 2024
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l’imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Abstract

Le complicanze dopo il trapianto di polmone sono in gran parte correlate alla risposta del sistema immunitario dell’ospite al trapianto. Tali risposte immunitarie sono regolate dal crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi. Una migliore comprensione di questi processi si basa sull’uso di modelli animali preclinici ed è aiutata dalla capacità di studiare il traffico di cellule immunitarie all’interno del trapianto in tempo reale. La microscopia intravitale a due fotoni può essere utilizzata per l’imaging di tessuti e organi per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotodanno minimo, il che offre un grande vantaggio rispetto alla microscopia confocale a singolo fotone. L’uso selettivo di topi transgenici con espressione proteica fluorescente promotore-specifica e/o il trasferimento adottivo di cellule marcate con colorante fluorescente durante la microscopia intravitale a due fotoni consente lo studio dinamico di singole cellule all’interno del loro ambiente fisiologico. Il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica per stabilizzare i polmoni di topo, che ci ha permesso di visualizzare le dinamiche cellulari nei polmoni naïve e negli innesti polmonari trapiantati ortotopicamente. Questa tecnica consente una valutazione dettagliata del comportamento cellulare all’interno del sistema vascolare e nell’interstizio, nonché l’esame delle interazioni tra le varie popolazioni cellulari. Questa procedura può essere facilmente appresa e adattata per studiare i meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie e tollerogeniche dopo il trapianto di polmone. Può anche essere esteso allo studio di altre condizioni polmonari patogene.

Introduction

Il trapianto di polmone è l’opzione finale per molti pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale; Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di polmone è scarsa rispetto ad altri trapianti di organi solidi. La sopravvivenza a 5 anni è solo ~60%-70%1, rispetto all’80%-90% nei cuori2 e all’85%-90% nei reni3. Molte complicanze dopo il trapianto di polmone, come la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto mediato da anticorpi e la disfunzione cronica dell’allotrapianto polmonare, sono dovute alla risposta immunitaria dell’ospite all’allotrapianto. Ad esempio, il nostro gruppo ha dimostrato che i neutrofili vengono rapidamente reclutati nell’allotrapianto polmonare a seguito di danno da ischemia-riperfusione indotta dal trapianto e formano cluster dinamici che circondano i monociti del sangue4. Il crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi è responsabile delle risposte alloimmunitarie deleterie 5,6,7 e la capacità di studiare queste interazioni cellulari dinamiche in un modello animale vivo è inestimabile.

La microscopia a due fotoni consente l’imaging intravitale ad alta risoluzione per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotosbiancamento minimo dei tessuti 8,9. Viene utilizzato in una varietà di tessuti e siti anatomici, tra cui la neocorteccia10,11, la pelle12,13 e il rene 14,15. Più recentemente, è stato adattato a organi non statici come il polmone e il cuore 4,16,17. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l’imaging di innesti polmonari stabilizzati, ventilati e perfusi dopo trapianto di polmone sinistro ortotopico murino. Un vantaggio chiave del modello di trapianto è la capacità di manipolare geneticamente il donatore e il ricevente separatamente. Le singole popolazioni cellulari possono essere visualizzate con ceppi di topi transgenici con espressione proteica fluorescente knock-in, trasferimento adottivo di cellule marcate con fluorescenza5 o iniezione endovenosa di anticorpi marcati con fluorescenza per legare marcatori specifici della cellula 4,16,17,18.

Al fine di stabilizzare il polmone durante l’imaging, questo protocollo prevede l’incollaggio del polmone a un vetrino di copertura, mentre altri gruppi hanno descritto la stabilizzazione dell’aspirazione utilizzando un dispositivo di vuoto reversibile su misura19. Il nostro protocollo presenta diversi vantaggi, tra cui un’area di imaging più ampia e una relativa facilità di configurazione utilizzando materiali comunemente disponibili in un laboratorio di microscopia (inclusi vetrino coprioggetto e colla). Poiché questa tecnica di incollaggio vincola il polmone sulla superficie superiore, si prevede che riduca il movimento ventilatorio e consenta un imaging più profondo. Questa tecnica di imaging intravitale consente un’osservazione dettagliata del comportamento e delle interazioni delle cellule immunitarie in tempo reale, contribuendo allo studio dei meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie rispetto a quelle tollerogeniche dopo il trapianto di polmone.

Protocol

Tutte le procedure di manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso la Washington University School of Medicine. 1. Anestesia e intubazione NOTA: Viene eseguito il trapianto ortotopico di polmone sinistro di topo, come precedentemente d…

Representative Results

Dopo 1 ora di conservazione ischemica a freddo a 4 °C, abbiamo trapiantato ortotopicamente il polmone sinistro da un topo B6 a un B6. LysM-GFP sul topo4, e quindi è stato eseguito l’imaging intravitale a due fotoni, come descritto sopra. Abbiamo eseguito l’imaging in due punti temporali dopo il trapianto: 2 ore (Figura 3A) e 24 ore (Figura 3B). I vasi sanguigni sono etichettati in rosso dai punti q inie…

Discussion

L’eccitazione a due fotoni è stata descritta per la prima volta nella sua tesi di dottorato da Maria Göppert-Mayer nel 1931, che in seguito vinse il premio Nobel per la fisica per aver descritto la struttura del guscio nucleare22,23. La microscopia a fluorescenza tradizionale si basa sull’eccitazione di un singolo fotone, con lunghezze d’onda di eccitazione più corte e più elevate rispetto alle lunghezze d’onda di emissione. …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni del NIH 1P01AI11650 e della Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Ringraziamo l’In Vivo Imaging Core della Washington University School of Medicine.

Materials

0.75% povidone-iodine Aplicare NDC 52380-0126-2 For disinfectant
1-inch 20G IV catheter Terumo SROX2025CA For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape Durapore 3M ID 7100057168 To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens Olympus N20X-PFH
3M Vetbond glue Medi-Vet.com 10872 To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots ThermoFisher Q21021MP For labeling of blood vessels
70% ethanol Sigma Aldrich EX0281 For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen McKesson 231
Black O ring (2 cm) Hardware store N/A For custom-built imaging chamber
Bolt (2) Hardware store N/A For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2) Hardware store N/A For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL Fidelis Animal Health NDC 86084-100-30 For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser Coherent N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm) Thomas Scientific 1202F63 For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1) Fine Science Tools 13009-12
Dual channel heater controller Warner Instruments TC-344B
Fine scissors (1) Fine Science Tools 15040-11
Fixed-stage upright microscope Olympus BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm) McKesson 476709 To place under left lung
High vacuum grease Dow Corning N/A To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1% Sigma Aldrich 26675-46-7 For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL Vedco NDC 50989-996-06 For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm) Hardware store N/A For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators Solon 56225 To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper Oster 078400-020-001
Puralube Vet eye ointment Medi-Vet.com 11897 To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator Harvard Apparatus 55-0000
Straight forceps (1) Fine Science Tools 91113-10
Three channel shutter driver Uniblitz VMM-D3 Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor Prior Scientific OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL Akorn NDC 59399-110-20 For pain control

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Citazione di questo articolo
Bai, Y. Z., Terada, Y., Mineura, K., Yokoyama, Y., Nava, R. G., Krupnick, A. S., Gelman, A. E., Miller, M. J., Kreisel, D., Li, W. Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung. J. Vis. Exp. (206), e66566, doi:10.3791/66566 (2024).

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