Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie
Summary
Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.
Abstract
La ghiandola mammaria è una struttura fondamentale del seno e svolge un ruolo essenziale nella riproduzione. Le cellule epiteliali mammarie umane (HMEC), che sono le cellule originarie del cancro al seno e di altre malattie infiammatorie correlate al seno, hanno attirato una notevole attenzione. Tuttavia, l’isolamento e la coltura di HMEC primari in vitro per scopi di ricerca è stato impegnativo a causa della loro natura altamente differenziata e cheratinizzazione e della loro breve durata. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficiente per isolare e coltivare gli HMEC è di grande valore scientifico per lo studio della biologia mammaria e delle malattie correlate al seno. In questo studio, siamo riusciti a isolare gli HMEC primari da piccole quantità di tessuto mammario mediante digestione con una miscela di enzimi combinata con una coltura iniziale in siero fetale bovino-DMEM al 5% contenente l’inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632, seguita da espansione della coltura in terreno cheratinocitario privo di siero. Questo approccio promuove selettivamente la crescita delle cellule epiteliali, con conseguente resa cellulare ottimizzata. La semplicità e la convenienza di questo metodo lo rendono adatto sia per la ricerca di laboratorio che per quella clinica, che dovrebbe fornire preziose informazioni su queste importanti aree di studio.
Introduction
Il cancro al seno è il principale tipo di cancro diagnosticato nelle donne a livello globale ed è la principale causa di morte per cancro1. La patogenesi del cancro al seno è complessa e coinvolge molteplici fattori come la genetica, l’ambiente e lo stile di vita. Le HMEC, cellule attive che producono latte, sono uno dei componenti più importanti del tessuto mammario e probabilmente sono le cellule originali coinvolte nella carcinogenesi del cancro al seno. Pertanto, gli HMEC hanno ricevuto la massima attenzione dai ricercatori per lo studio del cancro al seno2. Inoltre, le cellule primarie hanno la capacità di fornire una caratterizzazione biologicamente rilevante di processi cellulari complessi grazie al loro mantenimento della stabilità genetica, della normale morfologia e di un insieme più completo di funzioni cellulari di base che non possono essere raggiunte con linee cellulari immortalizzate3. Pertanto, l’isolamento e la coltura degli HMEC primari è un passo essenziale per lo studio della maggior parte delle malattie legate al seno come il cancro al seno e le malattie infiammatorie al seno.
Attualmente, è stato stabilito un sistema stabile e riproducibile per l’isolamento, la coltura e l’identificazione di cellule epiteliali mammarie da ratti, mucche, suini e capre 4,5,6,7. Tuttavia, l’isolamento e la coltura degli HMEC primari sono difficili a causa del complesso microambiente e della bassa resa delle cellule. Per decenni, gli scienziati hanno cercato il metodo più efficace per isolare e coltivare gli HMEC, anche se un sistema di coltura per gli HMEC è stato istituito quasi 20 anni fa. Ad esempio, Hammond et al. hanno sviluppato un terreno di coltura privo di siero in cui gli HMEC sono cresciuti in modo efficiente8. Recentemente, Zubeldia-Plazaola et al. hanno testato quattro diversi metodi di isolamento utilizzando procedure di digestione enzimatica veloce/lenta combinate con fasi di filtrazione sequenziale o centrifugazione differenziale per ottenere HMEC9. Hanno scoperto che il metodo della digestione lenta insieme alla centrifugazione differenziale è il metodo più efficiente per isolare gli HMEC dal tessuto mammario fresco. Tuttavia, questo metodo di isolamento richiede grandi pezzi di tessuto (40-75 g) e utilizza quantità maggiori di enzimi per la digestione. La loro procedura è complicata (almeno tre diverse centrifugazioni per ottenere diverse frazioni cellulari), oltre che dispendiosa in termini di tempo. Pertanto, è ancora necessario un metodo semplice e rapido per ottenere in modo efficiente popolazioni di HMEC da piccole quantità di tessuto mammario per la ricerca e le applicazioni cliniche9.
I nostri studi precedenti hanno dimostrato che l’aggiunta dell’inibitore della chinasi associata Rho (ROCK) Y-27632 nel terreno di coltura iniziale può semplificare il processo di isolamento delle cellule epidermiche della pelle umana10, che è stato utilizzato con successo anche per l’isolamento delle cellule epiteliali gengivali11. Inoltre, ricerche precedenti condotte dal gruppo di Zubeldia-Plazaola e dal gruppo di Jin hanno indicato che Y-27632 ha la capacità di stimolare la crescita rapida e illimitata in vitro di cellule epiteliali primarie derivate dal tessuto mammario 9,12. Il presente studio mirava a verificare se l’uso di Y-27632 avrebbe semplificato l’isolamento e la coltura degli HMEC e abbiamo stabilito con successo un metodo semplice e facilmente eseguibile per isolare gli HMEC da piccoli pezzi (1 g) di tessuto mammario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli HMEC sono vitali per preservare l’integrità anatomica e funzionale del tessuto mammario e sono utili nelle indagini scientifiche, nelle implementazioni cliniche e nei domini associati15. Le cellule epiteliali primarie sono un tipo di cellule specializzate che hanno passaggi limitati e una durata di vita più breve. Tuttavia, la crescita degli HMEC è stata ostacolata da vincoli tecnici, che hanno di conseguenza ostacolato i progressi della ricerca sul cancro al seno e su altre malattie infiam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di scienza e tecnologia TCM della provincia di Zhejiang, Cina (2017ZA055; 2018ZA036) e il progetto scientifico e tecnologico di Zunyi, provincia di Guizhou, Cina (Zunyi City Kehe Support NS (2020) n. 18) a X. Xu. Gli autori ringraziano il Laboratorio di Biologia Molecolare della Società di Tecnologia Biomedica Youjia (Hangzhou) per aver fornito formazione sulle colture cellulari.
Materials
| 0.05% Trypsin | Basalmedia | K431010 | For HMECs dissociation |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | NEST | 081722CK01 | For cell digestion |
| 100 µm mesh filter | Solarbio | 431752 | For HMECs filtration |
| 100 mm Cell Culture Dish | Corning | 430167 | For cell culture |
| 4% paraformaldehyde | solarbio | P1110-100ml | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | For cell centrifugation |
| Cell Strainer | Solarbio | 431752 | Cell filtration |
| Centrifuge | Eppendorf | 5404HN133048 | Cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 42820906 | For cell incubation |
| Collagenase Type I | Merck | SKU:SCR103 | For HMECs isolation |
| Dispase | Solarbio | CAS:42613-33-2 | For HMECs isolation |
| DMEM | Gibco | 8122622 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2556132P | Component of neutralization medium |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Phosphate buffered solution | Tecono | 20201033 | Washing solution |
| rabbit anti CK7 | abcam | ab68459 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| rabbit anti GATA3 | abcam | ab199428 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HMECs |
| Y-27632 | Solarbio | IY0040 | ROCK inhibitor |
Riferimenti
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