Summary

Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Published: March 01, 2024
doi:

Summary

Un metodo di registrazione elettrofisiologica raramente utilizzato, la registrazione di base, consente l’analisi di caratteristiche della codifica del gusto che non possono essere esaminate con i metodi di registrazione convenzionali. La registrazione delle basi consente anche l’analisi delle risposte gustative a stimoli idrofobici che non possono essere studiati con metodi elettrofisiologici tradizionali.

Abstract

Gli insetti assaporano il mondo esterno attraverso i peli del gusto, o sensilla, che hanno i pori sulla punta. Quando un sensillum entra in contatto con una potenziale fonte di cibo, i composti della fonte di cibo entrano attraverso il poro e attivano i neuroni all’interno. Per oltre 50 anni, queste risposte sono state registrate utilizzando una tecnica chiamata registrazione delle mance. Tuttavia, questo metodo presenta importanti limitazioni, tra cui l’incapacità di misurare l’attività neurale prima o dopo il contatto con lo stimolo e il requisito che i tastanti siano solubili in soluzioni acquose. Descriviamo qui una tecnica che chiamiamo registrazione di base, che supera queste limitazioni. La registrazione delle basi consente di misurare l’attività dei neuroni del gusto prima, durante e dopo lo stimolo. Pertanto, consente un’analisi approfondita delle risposte OFF che si verificano dopo uno stimolo gustativo. Può essere utilizzato per studiare composti idrofobici come i feromoni a catena lunga che hanno una solubilità molto bassa in acqua. In sintesi, la registrazione di base offre i vantaggi dell’elettrofisiologia a singolo sensillum come mezzo per misurare l’attività neuronale – alta risoluzione spaziale e temporale, senza la necessità di strumenti genetici – e supera i limiti chiave della tradizionale tecnica di registrazione della punta.

Introduction

Gli insetti, comprese le mosche drosofilide, sono dotati di un sofisticato sistema di gusto che consente loro di estrarre informazioni chimiche complesse dall’ambiente circostante. Questo sistema consente loro di discernere la composizione chimica di varie sostanze, distinguendo tra quelle nutrienti e quelle dannose 1,2.

Al centro di questo sistema ci sono strutture specializzate note come peli del gusto o sensilla, posizionate strategicamente su varie parti del corpo. Nelle mosche drosofilidi, questi sensilli si trovano sul labello, che è il principale organo gustativo della testa della mosca 1,2,3,4, nonché sulle zampe e sulle ali 1,2,5,6. Il labello si trova all’estremità della proboscide e contiene due lobi 4,7,8. Ogni lobo è ricoperto da 31 sensilli gustativi classificati come corti, lunghi e intermedi 4,7,8. Questi sensilli ospitano ciascuno 2-4 neuroni gustativi 1,2,9,10. Questi neuroni del gusto esprimono membri di almeno quattro diverse famiglie di geni, vale a dire i geni del recettore gustativo (Gr), del recettore ionotropico (Ir), del borseggiatore (Ppk) e del potenziale del recettore transitorio (Trp) 1,2,11,12,13. Questa diversità di recettori e canali fornisce agli insetti la capacità di riconoscere un’ampia gamma di composti chimici, inclusi segnali non volatili e volatili 1,2,14.

Per oltre 50 anni, gli scienziati hanno quantificato la risposta dei neuroni del gusto e dei loro recettori utilizzando una tecnica chiamata registrazione della punta 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Tuttavia, questo metodo presenta grosse limitazioni. In primo luogo, l’attività neurale può essere misurata solo durante il contatto con lo stimolo e non prima o dopo il contatto. Questa limitazione preclude la misurazione dell’attività di picco spontaneo e impedisce la misurazione delle risposte OFF. In secondo luogo, possono essere testati solo i sapori solubili in soluzioni acquose.

Queste limitazioni possono essere superate da una tecnica elettrofisiologica alternativa raramente utilizzata chiamata “registrazione di base”. Qui descriviamo questa tecnica, che abbiamo adattato da un metodo utilizzato da Marion-Poll e colleghi24, e mostriamo le caratteristiche cruciali della codifica del gusto che ora può comodamente misurare14.

Protocol

Il seguente protocollo è conforme a tutte le linee guida per la cura degli animali dell’Università di Yale. 1. Mosche Mettere 10-15 mosche appena emerse in fiale di coltura standard fresche a 25 °C e 60% di umidità relativa in un ciclo luce-buio di 12:12 ore. Usa le mosche quando hai 3-7 giorni. 2. Stimoli chemiosensoriali Ottenere stimoli chemiosensoriali della massima purezza disponibile. Co…

Representative Results

La Figura 4A mostra i picchi spontanei che derivano da un sensillo. Si dividono in due classi in base all’ampiezza, con i picchi più grandi derivanti dal neurone che è sensibile ai composti amari e i picchi più piccoli dal neurone che risponde agli zuccheri. La relazione tra ampiezza del picco e specificità funzionale è stata corroborata da esperimenti genetici 4,14,37,38,39 .<sup cl…

Discussion

Nelle registrazioni di alcuni tipi di sensilli, può essere difficile differenziare i picchi di diversi neuroni. Ad esempio, i neuroni dello zucchero e i neuroni meccanosensoriali dei sensilli S e I producono picchi di ampiezza simile, rendendo difficile distinguerli 4,14. Troviamo che l’uso di un elettrodo di registrazione al tungsteno molto affilato riduce l’attivazione del neurone meccanosensoriale, così come il posizionamento giudizioso dell’elettrodo di reg…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Zina Berman per il supporto, Lisa Baik per i commenti sul manoscritto e altri membri del laboratorio Carlson per la discussione. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH K01 DC020145 a H.K.M.D; e NIH concede R01 DC02174, R01 DC04729 e R01 DC011697 a J.R.C.

Materials

Microscope Olympus BX51WI equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration Table TMC 63-7590E
motorized Micromanipulators Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual Micromanipulators Märzhäuser Micromanipulators MM33 Micromanipulator
Magnetic stands ENCO Model #625-0930
Reference  and recording Electrode Holder Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary Holder Ockenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended Probe Ockenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus Controllers Ockenfels Syntech GmbH Stimulus Controller CS 55
Personal Computer Dell Vostro Check for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten Rod A-M Systems Cat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday Cage Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Stereomicroscope Olympus VMZ 1x-4x For fly preparation
p200 Pipette Tips Generic
Microloader tips  Eppendorf E5242956003
1 ml Syringe Generic
Crocodile clips
Power Transformers STACO ENERGY PRODUCTS STACO 3PN221B Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay Generic
Forceps Generic
Plastic Tubing Saint Gobain Tygon S3™ E-3603
Standard culture vials Archon Scientific Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER) Sigma-Aldrich Cat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN) Sigma-Aldrich Cat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) Sigma-Aldrich Cat# 36542

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Citazione di questo articolo
Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (205), e66665, doi:10.3791/66665 (2024).

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