Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi

Studi precedenti hanno scoperto che l'ippocampo è una struttura cerebrale essenziale per l'elaborazione e il recupero dei ricordi ^1,2. Dagli anni '50, i circuiti neurali dell'ippocampo nei roditori sono stati al centro dello studio della formazione, dell'archiviazione e del recupero della memoria³. Le strutture anatomiche all'interno dell'ippocampo includono le sottoregioni del giro dentato (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 e il subiculum⁴. Esistono complesse connessioni bidirezionali tra queste sottoregioni, di cui DG, CA1 e CA3 formano un circuito trisinaptico prominente costituito da cellule granulari e cellule piramidali⁵. Questo circuito riceve il suo input primario dalla corteccia entorinale (EC) ed è stato un modello classico per lo studio della plasticità sinaptica. Precedenti ricerche in vivo sulla funzione dell'ippocampo si sono concentrate principalmente sul CA1 ^6,7 a causa del suo più facile accesso. Mentre i neuroni CA1 svolgono un ruolo importante nella formazione, nel consolidamento e nel recupero della memoria, in particolare nelle cellule di posizione per la memoria spaziale, anche altre sottoregioni dell'ippocampo sono vitali ^8,9. In particolare, recenti studi hanno evidenziato le funzioni della DG nella formazione della memoria. È stato riportato che le cellule di posizione in DG sono più stabili di quelle in CA1¹⁰ e le loro attività riflettono informazioni specifiche del contesto¹¹. Inoltre, la marcatura dipendente dall'attività delle cellule granulari DG può essere riattivata per indurre comportamenti correlati alla memoria¹². Pertanto, per ottenere una comprensione più profonda della codifica delle informazioni in DG, è fondamentale studiare le attività della sottoregione DG mentre l'animale svolge compiti dipendenti dalla memoria.

Studi precedenti sulle attività della DG hanno utilizzato principalmente l'elettrofisiologia in vivo ¹³. Tuttavia, questa tecnica presenta alcuni inconvenienti: in primo luogo, nelle registrazioni elettriche, può essere difficile identificare direttamente i vari tipi di cellule che generano il segnale. I segnali registrati provengono sia da cellule inibitorie che eccitatorie. Pertanto, sono necessari ulteriori metodi di elaborazione dei dati per separare questi due tipi di celle. Inoltre, è difficile combinare altre informazioni sul tipo di cellula, come i sottogruppi specifici della proiezione o l'etichettatura dipendente dall'attività, con le registrazioni elettriche. Inoltre, a causa della morfologia anatomica del DG, gli elettrodi di registrazione sono spesso impiantati in una direzione ortogonale, il che limita notevolmente il numero di neuroni che possono essere registrati. Pertanto, è difficile per le registrazioni elettriche ottenere il monitoraggio di centinaia di singoli neuroni dalla struttura DG nello stesso animale¹⁴.

Una tecnica complementare di registrazione delle attività dei neuroni in DG consiste nell'utilizzare l'imaging del calcio in vivo ¹⁵. Gli ioni calcio sono fondamentali per i processi di segnalazione cellulare negli organismi, svolgendo un ruolo cruciale in molte funzioni fisiologiche, soprattutto all'interno del sistema nervoso dei mammiferi. Quando i neuroni sono attivi, la concentrazione intracellulare di calcio aumenta rapidamente, riflettendo la natura dinamica dell'attività neuronale e della trasmissione del segnale. Pertanto, la registrazione in tempo reale dei cambiamenti nei livelli intracellulari di calcio nei neuroni fornisce importanti informazioni sui meccanismi di codifica neurale.

La tecnologia di imaging del calcio utilizza coloranti fluorescenti specializzati o indicatori di calcio geneticamente modificati (GECI) per monitorare le concentrazioni di ioni calcio nei neuroni rilevando i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza, che possono quindi essere catturati attraverso l'imaging microscopico¹⁶. Comunemente, viene impiegata la famiglia GCaMP di geni indicatori del calcio, che comprende la proteina fluorescente verde (GFP), la calmodulina e le sequenze polipeptidiche M13. GCaMP può emettere fluorescenza verde quando si lega agli ioni calcio¹⁷, consentendo di registrare le fluttuazioni della fluorescenza verde tramite imaging¹⁸. Inoltre, per ottenere immagini chiare della regione del cervello bersaglio, una lente con indice di gradiente (lente GRIN) viene tipicamente impiantata sopra la regione di interesse. La lente GRIN consente l'imaging della regione profonda del cervello a cui non è possibile accedere direttamente dalla superficie.

Questa tecnica è relativamente facile da combinare con altri strumenti genetici per marcare diversi tipi di cellule. Inoltre, poiché il piano di imaging è parallelo all'orientamento delle cellule in DG, centinaia di neuroni sono accessibili per l'imaging con ogni intervento chirurgico riuscito. In questo lavoro, presentiamo un protocollo chirurgico completo e dettagliato per l'imaging in vivo del calcio nel giro dentato nei topi (Figura 1). La procedura prevede due operazioni principali. Il primo è quello di iniettare il virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f nel DG. La seconda operazione consiste nell'impiantare una lente GRIN sopra il sito di iniezione del virus. Queste due procedure vengono eseguite nella stessa seduta. Dopo il recupero da questi interventi chirurgici, il passo successivo è quello di controllare la qualità dell'imaging con microscopi miniaturizzati (miniscopi). Se il campo di imaging ha centinaia di cellule attive, la procedura successiva consiste nel fissare la piastra di base del miniscopio al cranio del topo utilizzando cemento dentale; Il mouse può quindi essere utilizzato per esperimenti di imaging. Presentiamo anche una pipeline di pre-elaborazione basata su MATLAB per semplificare l'analisi dei dati raccolti sul calcio.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Fudan (202109004S). Tutti gli animali utilizzati in questo studio erano C57BL/6J di 6 mesi; Sono stati utilizzati entrambi i sessi. I topi sono stati tenuti su un ciclo di luce di 12 ore, dalle 8 del mattino alle 8 di sera. Abbiamo utilizzato le seguenti coordinate per l'iniezione del virus in DG: A/P: -2,2 mm, M/L: 1,5 mm, D/V: 1,7 mm dalla superficie cerebrale.

1. Iniezione di virus nel giro dentato

1. Indossare dispositivi di protezione, inclusi guanti e camici sterili monouso.
2. Preparare gli strumenti chirurgici necessari, due provette da 5 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl [sterile] o liquido cerebrospinale artificiale) e due aghi smussati luer lock da 25 G.
   NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere accuratamente sterilizzati prima dell'operazione. Per sterilizzare gli strumenti chirurgici abbiamo utilizzato l'autoclave ad alta temperatura (121-134 °C) e pressione (20 psi). Inoltre, abbiamo spruzzato le superfici con disinfettanti a base alcolica. In tutte le procedure chirurgiche, abbiamo utilizzato una soluzione salina sterile allo 0,9%. Gli strumenti sono stati sterilizzati in modo intermittente durante l'intervento chirurgico con perle di vetro riscaldate.
3. Preparare una soluzione di candeggina al 10% in acqua per disinfettare eventuali forniture che potrebbero entrare in contatto con il virus.
4. Diluire il virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f se necessario, utilizzando soluzione fisiologica sterilizzata, e conservarlo in frigorifero a 4 °C o in ghiaccio. Il titolo finale target del virus è 1 × 10¹² GC/mL.
   NOTA: Si consiglia di evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento del virus per preservarne l'integrità. A tal fine, generalmente aliquotiamo il virus quando viene ricevuto dal produttore in piccoli volumi (ad esempio, 2 μl per provetta) e li conserviamo in un congelatore a -80 °C. Il virus deve essere utilizzato il giorno dello scongelamento e non deve essere conservato a 4 °C per un uso a lungo termine.
5. Utilizzare un estrattore per micropipette per tirare la micropipetta fino a una punta sottile, tagliare una piccola parte della punta con le forbici chirurgiche e riempire il tubo con olio minerale. Assicurarsi che la pipetta possa aspirare normalmente il liquido, quindi installarla sull'iniettore.
   NOTA: Abbiamo utilizzato un metodo di trazione in un solo passaggio con il riscaldatore impostato a ~60% della potenza massima. Per questo passaggio possono essere utilizzati altri estrattori. L'obiettivo generale è quello di rendere la punta di ~50-100 μm di diametro; un diametro troppo piccolo influenzerà il flusso del liquido; Troppo spesso può causare danni al tessuto cerebrale del topo.
6. Accendi tutti gli strumenti, inclusa la macchina per l'anestesia del mouse, la macchina per il mantenimento della temperatura (termoforo) e la pompa del vuoto. Inoltre, misurare il peso corporeo dei topi prima dell'intervento chirurgico.
   NOTA: Durante la procedura, abbiamo monitorato visivamente la respirazione del topo e occasionalmente controllato la temperatura corporea per assicurarci che fosse in buone condizioni.
7. Mettere il topo nella camera a gas con isoflurano al 2,5% e 1 L di ossigeno/min. Monitorare le condizioni respiratorie del topo per valutare lo stato dell'anestesia.
   NOTA: La frequenza respiratoria dovrebbe essere di circa 1 respiro/s per mantenere il mouse in buona salute.
8. Togliete il topo dalla camera a gas e posizionatelo sull'apparecchio stereotassico.
9. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato prima di iniziare l'operazione successiva. Testare il riflesso di ritiro del pedale pizzicando i cuscinetti dei piedi di entrambe le zampe posteriori. Se il mouse risponde al pizzico del poggiapiedi, somministrare ulteriore anestesia e ritestare il riflesso prima di procedere.
10. Coprire il naso del topo con una maschera e impostare la portata dell'isoflurano all'1,5%. Fissare saldamente la testa del mouse con le barre auricolari (Figura 2A).
    NOTA: Fare attenzione a non fissare le barre auricolari troppo strette sul mouse poiché ciò potrebbe facilmente influire sulla respirazione del mouse e, in alcuni casi, causare la morte.
11. Taglia la parte superiore della testa del topo con le forbici chirurgiche e usa la crema depilatoria per rimuovere i peli rimasti fino a quando la pelle non è completamente esposta. Applicare la crema depilatoria sul cuoio capelluto del topo, lasciarla riposare per circa 5 minuti e utilizzare una garza per rimuovere la crema.
12. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi del topo.
13. Disinfettare l'area glabra con disinfettante iodoforo ed etanolo al 75% utilizzando tamponi di cotone.
14. Praticare un'incisione continua lungo la linea mediana del cuoio capelluto utilizzando le forbici chirurgiche (o la lama di un bisturi) e tagliare parte del cuoio capelluto per esporre la superficie del cranio (Figura 2B). Sciacquare la superficie del cranio con soluzione fisiologica; Quindi, rimuovere la fascia e la soluzione salina in eccesso utilizzando una pompa a vuoto. Ripeti questo processo più volte fino a quando l'area intorno alla ferita smette di sanguinare. Pulisci la superficie del cranio con tamponi di cotone per mantenerlo asciutto.
    NOTA: Esistono altri modi per rimuovere la fascia, ad esempio asciugandola con un batuffolo di cotone o un batuffolo di cotone.
15. Utilizzare l'ago di localizzazione per regolare la superficie cranica quando la bregma e la lambda sono visibili. Effettuare diverse regolazioni fino a livellare l'intera testa (l'intero errore nella direzione dell'asse Z è inferiore a 0,05 mm).
16. Spostare la punta dell'ago dal bregma alla posizione target appropriata. Per le coordinate di destinazione, utilizzare il bregma come punto di riferimento. Segnare i quattro punti per definire il perimetro del sito di iniezione del virus: A/P: -2,0 mm, M/L: -1,5 mm; A/P: -2,5 mm, M/L: -1,5 mm; A/P -2,25 mm, M/L: -1,0 mm; e A/P -2,25 mm, M/L: -2,0 mm, con pennarello cancellabile.
    NOTA: Questo protocollo esegue l'iniezione del virus e l'impianto della lente GRIN nello stesso intervento chirurgico. In questo protocollo, tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti sull'emisfero destro, ma è concepibile che entrambi gli emisferi possano essere utilizzati. All'interno dell'area di iniezione definita dai quattro punti sopra menzionati, iniettare il virus in tre dosi separate da 80 nL in luoghi diversi. Sebbene le tre località siano state scelte arbitrariamente, si consiglia di disperderle per una migliore diffusione del virus. Ciò aumenterà il numero di cellule infette.
17. Fai la craniotomia nella regione con il microtrapano e imposta questi quattro punti come confine. Interrompere la perforazione quando il tessuto cerebrale è visibile (Figura 2C).
    NOTA: Prova a perforare il cranio lentamente. La punta del trapano può danneggiare il tessuto cerebrale a causa di una forza eccessiva. La perforazione lenta può anche prevenire il surriscaldamento del cervello.
18. Rimuovere i detriti ossei e la dura madre utilizzando una pinza ultra fine e sciacquare costantemente quest'area con soluzione fisiologica sterile.
    NOTA: È normale che si verifichi una piccola quantità di sanguinamento durante questa fase, poiché alcuni capillari si rompono; Continua a risciacquare con soluzione fisiologica fino a quando non ci sono più sanguinamenti.
19. Utilizzare il pannello di controllo dell'iniettore per espellere un po' di olio minerale per generare lo spazio necessario per il successivo caricamento del virus. Riempire la micropipetta con almeno 240 nL del virus diluito a una velocità di 100 nL/s.
    NOTA: Le bolle d'aria nella provetta devono essere scaricate utilizzando il pannello di controllo per garantire che la micropipetta eroghi la quantità appropriata di liquido. Se il volume del liquido è ancora impreciso dopo diversi tentativi, prendere in considerazione la possibilità di sostituire la micropipetta e ricominciare da capo. Si consiglia di aspirare un po' di virus in più rispetto al volume effettivo di iniezione; Questo approccio impedisce l'iniezione involontaria di olio minerale nel cervello del topo.
20. Spostare la micropipetta sopra la regione della craniotomia; quindi, spostalo lentamente verso il basso nel tessuto cerebrale fino all'asse Z mirato di D/V: 1,70 mm sotto la superficie del cervello.
    NOTA: Molti riferimenti nell'atlante usano la superficie del cranio come D/V 0. Nella nostra esperienza, l'utilizzo delle coordinate della superficie cerebrale ha prodotto un targeting più affidabile per DG.
21. Utilizzare il pannello di controllo per impostare l'iniettore in modo che inietti 80 nL di virus a una velocità di flusso di 1 nL/s (Figura 2D). Fare clic sul pulsante INIETTA sul pannello di controllo per iniettare il virus. Successivamente, selezionare altre due posizioni all'interno della craniotomia e ripetere l'operazione precedente.
    NOTA: Ogni iniezione dura ~2 min. Dopo aver terminato l'iniezione, attendere altri 8-10 minuti prima di passare a un'altra posizione. Quando si verifica sanguinamento durante la rimozione, lavare prontamente con soluzione fisiologica.
22. Rimuovere lentamente la micropipetta dal cervello (Figura 2E).

2. Impianto della lente GRIN nel giro dentato

NOTA: Eseguire questo passaggio immediatamente dopo aver completato l'iniezione virale da 240 nL.

1. Disinfettare la lente GRIN da 1 mm di diametro in etanolo al 75% per 20 minuti; Sciacquarlo accuratamente con soluzione fisiologica prima dell'impianto.
2. Espandere la craniotomia utilizzando il microtrapano per aumentare l'apertura nella direzione A/P a circa 1 mm. Eliminare i detriti con soluzione fisiologica.
3. Clamp la lente GRIN in posizione con un supporto e assicurarsi di esporre una lunghezza adeguata.
   NOTA: È facile incollare il supporto alla lente GRIN quando lo si fissa sul cranio utilizzando la resina UV nei passaggi successivi. Tuttavia, questo può essere evitato se la lunghezza esposta dell'obiettivo è adeguata.
4. Utilizzare il supporto per spostare la lente GRIN sopra la regione della craniotomia. Impostare la posizione dell'asse Z su zero quando la parte inferiore della lente GRIN tocca la superficie del tessuto cerebrale. Quindi, rimuovere il supporto dell'obiettivo GRIN e metterlo da parte.
5. Collegare l'ago smussato luer lock da 25 G al tubo di aspirazione della pompa del vuoto e regolare la pressione a 0,04 MPa.
   NOTA: Se questo passaggio viene eseguito per la prima volta, la pressione può essere opportunamente ridotta per aspirare lentamente il tessuto cerebrale.
6. Aspirare il tessuto cerebrale ruotando la punta dell'ago smussato vicino al di sopra del tessuto cerebrale e premere delicatamente sul tessuto cerebrale per facilitare l'aspirazione. Sciacquare continuamente con soluzione fisiologica (conservare a 4 °C) durante l'aspirazione per mantenere una visione chiara del cervello. Osservare attentamente le caratteristiche del tessuto per monitorare la profondità dell'aspirazione: il tessuto corticale è rosa pallido, il corpo calloso sottostante appare come tessuto bianco e fibroso e lo strato di CA1 dell'ippocampo è rosso scuro e grigio. Interrompere l'aspirazione quando la superficie del tessuto diventa liscia e viene esposta un'ampia area di CA1 (Figura 3).
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il successo dell'intera procedura ed è spesso la parte più difficile. Abbiamo fornito un elenco di problemi comuni per aiutare i lettori a risolvere questo passaggio (Tabella 1). Inoltre, si consiglia di sciacquare continuamente la ferita con soluzione fisiologica fredda, poiché ciò può ridurre in una certa misura il sanguinamento.
   1. Se l'ago si ostruisce; Collegare l'ago bloccato a una siringa e lavare via l'ostruzione. Prova a cambiare l'ago se questo non funziona.
   2. Se il sanguinamento è costante, può bloccare la vista del tessuto cerebrale. Se ciò accade, attendi che il sangue si coaguli, quindi risciacqualo con soluzione fisiologica.
7. Spostare il supporto sopra il foro praticato. Impostare l'asse Z su 0 quando la lente GRIN entra in contatto con la superficie del tessuto cerebrale. Se la lente GRIN supera il diametro del foro, utilizzare il microtrapano per espandere il foro. Quindi, ripeti questa procedura.
8. Inserire la lente GRIN nel foro in corrispondenza del D/V: -1,32 mm. Lasciare riposare il supporto per 5-10 minuti. Dopo aver sollevato il supporto, sciacquare il foro con soluzione fisiologica. Ripetere questo passaggio 3 volte (Figura 4A).
   NOTA: È normale che il tessuto cerebrale sanguini durante questo passaggio. Dopo ripetuti risciacqui salini, non dovrebbe esserci più sangue nel foro. La qualità dell'imaging è fortemente influenzata da questo passaggio e, se il sangue non viene pulito, il campo di imaging potrebbe essere nero.
9. Usa la soluzione salina per pulire accuratamente il cranio e poi lascia asciugare il cranio prima di applicare la resina UV.
10. Usa un ago per applicare la resina UV attorno alla lente GRIN. Illuminare quest'area con una luce UV per 15 s e assicurarsi che la resina UV diventi solida (Figura 4B).
    NOTA: Applicare la resina UV un po' alla volta e ripetere questa operazione più volte fino a coprire l'area intorno alla lente GRIN. Fare attenzione a non fissare la lente GRIN al supporto quando si utilizza la luce UV per l'illuminazione.
11. Rimuovere con cautela il supporto dalla lente GRIN. Copri l'intero cranio esposto con resina UV e posiziona la piastra sulla piastra sul cranio nella posizione appropriata. Illuminare l'intero cranio e la piastra con una luce UV per 15 s (Figura 4C).
    NOTA: La piastra per la testa è un componente per tenere saldamente in posizione la testa del mouse durante il fissaggio della piastra di base (vedere il file supplementare 1 per il design). Fissare la piastra di testa il più saldamente possibile; Un distacco della piastra comporterà il fallimento dell'intero intervento chirurgico. Nella nostra esperienza, l'applicazione accurata della resina UV dovrebbe essere in grado di fornire un fissaggio saldo. Se è necessario un fissaggio più forte, si potrebbe prendere in considerazione l'installazione di viti per cranio.
12. Coprire la lente GRIN esposta con un cappuccio protettivo stampato in 3D (vedere il file supplementare 2 per il design). Fissare il tappo alla piastra di testa utilizzando viti M1.6 (Figura 4D).
13. Iniettare il desametasone per via intraperitoneale (disciolto in soluzione fisiologica allo 0,9%, 2 mg/kg) dopo l'operazione per prevenire l'infiammazione postoperatoria. Inoltre, somministrare iniezioni sottocutanee di carprofene (disciolto in soluzione fisiologica allo 0,9%, 5 mg/kg) per ridurre il dolore postoperatorio.
14. Rimetti i topi nella gabbia e trasferiscili su una coperta termica per facilitarne il recupero. Quindi, trasferisci i topi nella casa degli animali da esperimento dopo che possono muoversi liberamente.
    NOTA: Per evitare danni alla piastra di base dovuti ai combattimenti, i topi che hanno subito l'intervento chirurgico possono essere alloggiati individualmente o con un numero minimo di conviventi. Si consiglia di non superare i tre topi in gabbia dopo l'intervento chirurgico.
15. Disinfettare le superfici di lavoro utilizzando una soluzione di candeggina al 10%. Rimuovere i dispositivi di protezione individuale (DPI) monouso e smaltirli in sacchetti a rischio biologico.
16. Monitorare i topi ogni giorno per 3 giorni dopo l'intervento. Registra il peso corporeo dei topi e osserva il loro stato di guarigione delle ferite e le attività di locomozione. Fornire iniezioni intraperitoneali giornaliere di soluzioni di desametasone e carprofene (lo stesso dosaggio del passaggio 2.13) per 3 giorni. Fornire cibo umido o trattamento per facilitare il recupero quando necessario.

3. Controllare la qualità del campo di imaging

NOTA: Il topo si riprende in 2-3 settimane dopo l'intervento chirurgico prima della prima sessione di imaging del calcio in vivo . Lo scopo di questa fase è verificare la qualità dell'intervento chirurgico e il recupero del topo. Se è possibile osservare l'attività di una singola cellula nel campo di imaging e il topo è in buone condizioni, applicare la piastra di base al cranio del topo. Il topo deve essere soppresso mediante lussazione cervicale se la qualità dell'imaging o le condizioni di salute non sono adeguate.

1. Collegare la scatola di raccolta dati del miniscopio al computer con un cavo USB 3.0. Quindi collegare il cavo coassiale alla scatola tramite il connettore To Scope (SMA).
2. Accendere il software di controllo del miniscopio. Nel software, fare clic su Seleziona file di configurazione | File di configurazione utente V4 plus per visualizzare le immagini dal vivo.
3. Utilizzare un supporto personalizzato per mantenere il mouse sul volante di scorrimento bloccando la piastra di testa. Tenere il miniscopio con il supporto del miniscopio (realizzato con la stampa 3D; vedere il file supplementare 3 per la progettazione) e utilizzare uno strumento stereotassico per spostare il miniscopio sopra la testa del mouse (Figura 4E).
4. Rimuovere il tappo con un cacciavite. Strofinare delicatamente la superficie della lente GRIN con etanolo al 75%. Posizionare il miniscopio appena sopra la lente GRIN esposta e rendere la superficie inferiore del cannocchiale parallela alla superficie della lente. Trova il miglior piano focale abbassando lentamente il miniscopio verso l'obiettivo GRIN.
   NOTA: Impostare il piano focale su 0, quindi regolare la posizione del miniscopio; Ciò fornisce più spazio per regolare la messa a fuoco. Seleziona il piano focale con una chiara visualizzazione del maggior numero di celle.
5. Nel software di controllo del miniscopio, regolare la potenza della luce LED al livello ottimale.
   NOTA: Per osservare l'attività di una singola cellula, il campo di imaging non deve essere né sovraesposto né troppo scuro. L'intensità del LED è in genere entro il 10%.
6. Se il flusso sanguigno vascolare è visibile e le cellule sono numerose e distribuite uniformemente in tutto il campo di imaging, procedere alla sezione successiva dell'esperimento.
   NOTA: In questa fase, è importante essere in grado di osservare l'attività di una singola cellula. Questo può influenzare i risultati dell'analisi dei dati. Normalmente, le attività regionali (blob di fluttuazioni fluorescenti) sono difficili da interpretare. Questo può essere un'indicazione che i neuroni bersaglio sono fuori fuoco della lente GRIN. Il topo non verrà utilizzato negli esperimenti successivi se sembra che il campo di imaging sia nero, che le cellule mostrino attività regionale o che il numero di cellule sia insufficiente.
7. Scollegare il cavo dal miniscopio.

4. Fissare la piastra di base del miniscopio al teschio del topo

1. Fissare la piastra di base al miniscopio e regolare nuovamente le posizioni del miniscopio per ottenere un campo visivo con una buona qualità dell'immagine.
2. Mescolare i materiali della base protesica nel boccale.
   NOTA: È importante che la miscela non scorra troppo liberamente né sia troppo soda. Troppa fluidità tende a coprire la superficie della lente GRIN causando la perdita di campo di imaging. Se troppo solidi, i materiali della base della protesi non saranno in grado di coprire ermeticamente lo spazio tra la piastra di base e la piastra per la testa.
3. Fare attenzione a non modificare la posizione del miniscopio mentre si applica con cura il primo strato di materiali di base della protesi attorno alla piastra di base del miniscopio. Attendere che il primo strato di cemento si indurisca prima di applicare un secondo strato di cemento dalla piastra di base alla piastra di testa. Dopo l'indurimento di tutti i materiali di base della protesi, allentare la vite di fermo e staccare il miniscopio dalla piastra di base.
   NOTA: Quando si utilizzano materiali per basi protesiche, prestare attenzione al campo di imaging nel software ed effettuare le regolazioni necessarie prima che il cemento si solidifichi.
4. Rimuovere delicatamente il braccio di supporto dal miniscopio.
5. Inserire il cappuccio della piastra di base nella piastra di base per proteggere la lente GRIN esposta e serrare la vite di fermo (Figura 4F).
6. Rimetti il mouse nella sua gabbia di casa. Concedi al topo diversi giorni per riprendersi prima di condurre gli esperimenti comportamentali.

5. Acquisizione dati

NOTA: L'imaging del calcio in vivo può essere eseguito contemporaneamente a qualsiasi test comportamentale. In questo protocollo, utilizziamo la traccia lineare come esempio. Questa pista lineare è di 1,5 m e ha acqua ad entrambe le estremità, che funge da ricompensa per i topi. I topi possono indossare un microscopio in miniatura (miniscopio) e correre avanti e indietro lungo la pista per una durata di 20 minuti. Durante questo periodo, i topi sono in genere in grado di eseguire ~ 60 prove.

1. Collegare la scatola di raccolta dati del miniscopio al computer con un cavo USB 3.0. Quindi collegare il cavo coassiale alla scatola tramite il connettore To Scope (SMA).
2. Accendere il software di controllo del miniscopio. Nel software di controllo miniscope, fare clic su Seleziona file di configurazione | File di configurazione utente V4 plus per visualizzare le immagini dal vivo.
3. Collegare la telecamera industriale al computer con un cavo USB 3.0.
4. Attiva il software di controllo della fotocamera. Nel software, fare clic su Apri attrezzatura e selezionare il file per importare i parametri di raccolta dati. Seleziona il formato video come Video non compresso nel contenitore AVI. Fare clic sul pulsante Start per visualizzare le immagini dal vivo.
   NOTA: Per ridurre le dimensioni del file del video di registrazione comportamentale, il campo visivo deve escludere tutte le aree non necessarie al di fuori della traccia.
5. Utilizzare un supporto personalizzato per mantenere il mouse sul volante di scorrimento bloccando la piastra di testa.
6. Allentare la vite di fermo con un cacciavite, rimuovere il cappuccio della piastra di base e pulire la superficie della lente GRIN con etanolo al 75%.
7. Montare il miniscopio sulla sua base. Fissare il miniscopio alla sua base sulla testa del topo.
8. Trova il piano focale migliore facendo scorrere il pulsante del piano focale.
9. Sposta delicatamente il mouse dal volante di scorrimento al binario lineare.
10. Fare clic e tenere premuto il pulsante Registra per iniziare la registrazione con il miniscopio. Quindi, fai clic sul pulsante Avvia raccolta per avviare la registrazione della fotocamera. Registra per 20 min.
11. Salva separatamente i dati di imaging del calcio in vivo , i dati comportamentali e i dati di Arduino. Assegna a questi file un nome con la data, il numero di sessione e il numero del mouse.
    NOTA: Gli studi che utilizzano un miniscopio tendono ad avere un periodo di raccolta dati a lungo termine su un singolo animale da esperimento. Nominare i file in modo chiaro può aiutare con la procedura di elaborazione dei dati.
12. Staccare il miniscopio dalla base.
13. Chiudere il software di controllo della fotocamera, il software di controllo del miniscopio e il computer.
14. Scollegare il cavo coassiale dall'oscilloscopio (SMA) e il cavo USB 3.0 dalla fotocamera.
15. Svitare la vite di fermo nella base, riposizionare il tappo della piastra di base e serrare la vite.
16. Rimetti il mouse nella sua gabbia di casa.

6. Trattamento dei dati

1. Caricare i dati di imaging del calcio registrati in MATLAB.
   NOTA: Riconosciamo che l'analisi dei dati dovrebbe essere adattata al disegno sperimentale. Qui forniamo una pipeline di pre-elaborazione che converte il video di imaging del calcio grezzo in tracce di attività da singole cellule. Riteniamo che questa procedura sia relativamente universale e utile per gli utenti. Tutti gli script descritti in questa sezione sono disponibili nel file supplementare 4.
2. Converti i dati di imaging dal formato AVI al formato HDF5 (.h5).
   NOTA: L'output grezzo del miniscopio genera file AVI con compressione. I file non compressi hanno solitamente una dimensione di decine di gigabyte. Il formato di file HDF5 consente l'accesso virtuale e parziale che può essere facilmente visualizzato e manipolato per l'analisi successiva.
3. Applicare la correzione del movimento non rigida (NoRMCorre)¹⁹.
4. Eseguire il downsampling del filmato con correzione del movimento nel caso in cui la RAM del computer sia limitata per i passaggi successivi.
   NOTA: I dati originali raccolti dal miniscopio hanno una dimensione di 600 x 600. Utilizzando un downsampling spaziale, è possibile ridurre le dimensioni del video a 200 x 200. Questo metodo riduce significativamente i requisiti di archiviazione dei dati e consente un'elaborazione più rapida dei dati.
5. Applicare EXTRACT sui dati sottocampionati per identificare i segnali di una singola cella, seguendo le istruzioni per il codice EXTRACT nel repository online²⁰ (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public).

La Figura 1 mostra lo schema della procedura sperimentale, compresa l'iniezione del virus, l'impianto della lente GRIN, l'apposizione della piastra di base, l'imaging del calcio in vivo tramite un miniscopio e l'elaborazione dei dati. Generalmente, l'intera procedura dura 1 mese. La Figura 2 mostra esempi di procedure di iniezione del virus, incluso il posizionamento del foro praticato sul cranio e le condizioni del tessuto cerebrale prima dell'impianto della lente GRIN.

La Figura 3 mostra il processo di rimozione del tessuto cerebrale, che è fondamentale per il successo di questo intervento chirurgico. Man mano che viene aspirato più tessuto, diventano visibili diversi strati di tessuto. Questa fase di aspirazione può essere interrotta una volta osservato uno strato grigio riflettente.

La Figura 4 mostra la procedura dell'impianto GRIN, compreso l'inserimento della lente GRIN, l'adesione della piastra sulla piastra sul cranio e la copertura della lente GRIN con un cappuccio personalizzato. La qualità dell'imaging del calcio in vivo dipende dal successo dell'iniezione del virus e dell'impianto della lente GRIN.

La Figura 5 mostra quattro tipi di risultatidell'imaging del calcio in vivo.La Figura 5A è il risultato non riuscito; Non sono state osservate cellule attive nel campo visivo dell'imaging. Figure 5B-D sono risultati positivi. La Figura 5B ha meno di 10 cellule attive, ma non ci sono vasi sanguigni evidenti. La Figura 5C ha più di 50 cellule attive e vasi sanguigni visibili. Nella Figura 5D, ci sono centinaia di cellule attive nel campo visivo dell'imaging; Allo stesso tempo, abbiamo osservato vasi sanguigni puliti. L'imaging del calcio in vivo di alta qualità ha in genere centinaia di cellule attivate. Si ritiene che meno di una dozzina di cellule attivate non siano ottimali per i risultati dell'imaging. Di solito, il numero di cellule è correlato al diametro della lente GRIN e alla parte della regione del cervello. Un diametro della lente GRIN più grande e una regione cerebrale più vicina al lato dorsale aumenteranno la probabilità di osservare più cellule attive. È anche fondamentale notare che maggiore è il diametro della lente GRIN, maggiore è il danno che provoca al cervello del topo; Pertanto, la selezione della taglia appropriata è fondamentale. L'impianto di una lente GRIN di 1 mm di diametro non influisce sulla capacità dell'animale di acquisire il comportamento della traccia lineare (Figura supplementare S1).

I dati comportamentali e i dati di imaging del calcio vengono solitamente elaborati separatamente. I dati comportamentali dei topi possono essere etichettati manualmente o elaborati utilizzando un software di analisi open source. I dati di imaging del calcio vengono elaborati utilizzando la correzione del movimento non rigido (NoRMCorre) ed EXTRACT in MATLAB. La Figura 6 mostra le singole cellule estratte sovrapposte al campo visivo e mostra cinque tracce di calcio rappresentative da una registrazione di imaging del calcio in vivo riuscita. Vedere il video supplementare S1 per un video rappresentativo dei dati non elaborati.

Verificare che l'impianto della lente GRIN e l'iniezione virale avvengano nella regione cerebrale prevista è l'ultimo passo ed è anche molto importante per l'interpretazione dei dati. La Figura 7 è una fetta di cervello di topo che mostra la posizione dell'espressione di GCaMP6f (la regione di fluorescenza verde) e la traccia della lente GRIN.

Figura 1: Schema delle procedure di iniezione del virus e impianto della lente GRIN. (A) Iniettare il virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f nel giro dentato. (B) Impiantare la lente GRIN sopra il giro dentato. (C) Controllare la qualità dell'imaging dopo l'intervento chirurgico. (D) Fissare la piastra di base del miniscopio dopo il controllo. (E) La tempistica e il processo dell'intero protocollo. Abbreviazione: GRIN = Indice di gradiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Vista chirurgica rappresentativa durante l'iniezione del virus. (A) Posizionare il topo sull'apparato stereotassico. (B) Contrassegnare l'area di impianto della lente GRIN (la regione nera). (C) Craniotomia sull'area bersaglio. (D) Iniettare 240 nL di virus nel giro dentato. (E) Rimuovere la micropipetta dopo l'iniezione. (F) Rimuovere la corteccia e parte del tessuto cerebrale CA1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vista chirurgica rappresentativa durante l'aspirazione del tessuto cerebrale. (A) La regione racchiusa dal marcatore nero viene lucidata utilizzando un microtrapano, lasciando dietro di sé (B) tessuto corticale parzialmente esposto. La parte sinistra mostra una corteccia esposta e la parte destra è coperta dalla dura madre e dal tessuto cranico. (C) Immagine rappresentativa durante l'aspirazione del tessuto cerebrale corticale. Il tessuto rimane rosa pallido. (D) La materia bianca è visibile all'interno del campo visivo, come indicato dalla freccia bianca. (E) Un'ulteriore aspirazione ha rivelato una superficie riflettente grigio-rossa scura sotto la sostanza bianca. Si pensa che la regione (freccia nera) sia la superficie del CA1 e l'aspirazione non dovrebbe andare più in profondità. (F) Non è più visibile sanguinamento dalla regione dopo aver risciacquato più volte con soluzione fisiologica. In tutti i pannelli, gli asterischi indicano gli strumenti chirurgici: un ago smussato da 30 G per la soluzione fisiologica e un ago smussato da 25 G per l'aspirazione del tessuto cerebrale. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Un esempio di procedura per l'impianto della lente GRIN e il fissaggio della piastra di base. (A) Impiantare la lente GRIN nel tessuto cerebrale utilizzando un supporto per lenti GRIN. (B) Far aderire la lente GRIN nella posizione corretta con resina UV; la parte riflettente rappresenta la resina UV. (C) Fissare la piastra sul cranio del topo utilizzando la resina UV. (D) Coprire la lente GRIN con un cappuccio protettivo stampato in 3D. (E) Controllare la qualità dell'intervento. Il miniscopio era fissato da un supporto. (F) Applicare i materiali della base della protesi attorno alla piastra di base. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati di imaging riusciti e non riusciti. (A) Risultato di imaging del calcio in vivo non riuscito. Non ci sono cellule attive in A e più regioni hanno macchie di sangue scuro come indicato dalle frecce nere. (B-D) Risultati di imaging del calcio in vivo di successo. (B) Si possono osservare meno di 10 cellule attive, ma nessun vaso sanguigno significativo nel campo di imaging. (C) Si possono osservare più di 50 cellule attive e vasi sanguigni significativi. (D) Si possono osservare centinaia di cellule attive e vasi sanguigni più significativi. I cerchi tratteggiati rappresentano il campo visivo dell'imaging. Le frecce verdi rappresentano le celle che esprimono GCaMP6f. Le frecce rosse rappresentano i vasi sanguigni. Barre di scala = 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Dati rappresentativi di imaging del calcio in vivo da un topo che corre sulla pista lineare. (A) La registrazione del campo visivo dell'imaging da parte del miniscopio, numero totale di celle = 227. (B) Tracce rappresentative di calcio. Le posizioni della cella sono mostrate con lo stesso colore in A. (C) Compito comportamentale: Percorso lineare con ricompense d'acqua ad entrambe le estremità. (D) Risultato rappresentativo dell'analisi comportamentale dell'attività del topo; tempo totale = 100 s. Le linee verticali blu indicano i punti temporali del comportamento di leccamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Sezioni di tessuto cerebrale di topi dopo l'intervento chirurgico. (A,B) Due esempi di tessuti cerebrali di topo. Le aree rettangolari tratteggiate indicano il percorso di impianto della lente GRIN. Le linee curve rappresentano il giro dentato nell'ippocampo. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Tabella di risoluzione dei problemi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: Acquisizione normale del compito di memoria spaziale da parte di topi che hanno subito un intervento chirurgico. Il grafico mostra la quantificazione del numero di prove completate nella sessione di 20 minuti ogni giorno. I dati sono rappresentati come media ± SEM. N = 3 topi nel gruppo con intervento chirurgico e 4 nel gruppo senza intervento chirurgico. L'ANOVA bidirezionale è stata utilizzata per il confronto statistico. Abbreviazione: ns = non significativo. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare S1: Dati grezzi rappresentativi dell'imaging del calcio in DG. Questo video mostra l'attività del calcio per un periodo di 5 minuti. Il video viene riprodotto a 10 volte la velocità originale. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Il design della piastra di testa. Questo file delinea il disegno 2D del design della piastra di testa. La produzione della piastra di testa prevede il taglio dell'acciaio inox secondo il disegno. I due piccoli fori sulla barra laterale devono essere filettati con filettature M1.6. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Il design del cappuccio protettivo stampato in 3D. Questo file fornisce il gcode delle fette del cappuccio protettivo che possono essere utilizzate con una stampante 3D. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la plastica dell'acido polilattico come materia prima per la stampa. I piccoli fori sul lato corrispondono alle posizioni dei fori filettati sulla piastra di testa per l'installazione. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Il design del supporto del miniscopio. Questo file fornisce il gcode delle fette del porta miniscopio che possono essere utilizzate con una stampante 3D. Il foro cilindrico viene utilizzato per l'installazione su un supporto stereotassico con una vite M4. I fori sul lato hanno lo scopo di aggiungere viti per il serraggio, ma il supporto può essere utilizzato senza questa funzione. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: codice di controllo Arduino e script per la pre-elaborazione video dell'imaging del calcio grezzo. Questo file contiene gli script per il controllo di Arduino e il codice per la pre-elaborazione dei dati di imaging del calcio. Il codice Arduino controlla l'impostazione del comportamento in cui il mouse impara a leccare per ottenere ricompense d'acqua alle estremità alternate di un binario lineare. Dopo aver appreso il compito, i topi correranno ripetutamente avanti e indietro sulla pista. Il codice di pre-elaborazione dell'imaging del calcio esegue la conversione del formato del file, la correzione del movimento, il down-sampling spaziale e l'estrazione del segnale cellulare dai dati raccolti dal miniscopio. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.