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Research Article
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Questa revisione esplora il modo in cui la Legionella pneumophila elude la xenofagia, evidenziando i meccanismi mediati dagli effettori e le loro implicazioni per la comprensione delle interazioni ospite-patogeno e lo sviluppo di nuove strategie anti-infettive.
L'autofagia, un processo eucariotico conservato per il mantenimento dell'omeostasi cellulare, svolge un ruolo cruciale nell'immunità innata prendendo di mira i patogeni intracellulari attraverso l'autofagia selettiva, nota come xenofagia. Mentre la xenofagia è vitale per l'eliminazione dei patogeni, molti batteri intracellulari hanno sviluppato strategie sofisticate per evitare o sovvertire questo processo. La Legionella pneumophila, un patogeno intracellulare Gram-negativo, manipola le vie dell'ospite attraverso un ampio repertorio di proteine effettrici veicolate attraverso il suo sistema di secrezione di tipo IV. Questa revisione riassume l'attuale comprensione dei meccanismi della xenofagia, tra cui il riconoscimento del carico, il reclutamento dell'adattatore e la degradazione lisosomiale, e descrive come L. pneumophila interrompe questi passaggi utilizzando effettori come RavZ, che scolpisce irreversibilmente LC3-II, e la famiglia SidE, che interferisce con l'ubiquitinazione dell'ospite mediante ubiquitinazione fosforibosilica. Discutiamo anche di ulteriori effettori che perturbano i processi correlati all'autofagia e delle più ampie intuizioni che queste strategie batteriche forniscono alla biologia della cellula ospite. Infine, evidenziamo le prospettive future sull'utilizzo della ricerca sulla xenofagia per lo sviluppo di terapie mirate contro le malattie infettive.
La prevalenza di ceppi batterici resistenti ai farmaci ha reso imperativa la ricerca di nuovi approcci antibatterici per combattere le malattie infettive. L'autofagia, un processo eucariotico fondamentale attraverso il quale le cellule sviluppano vescicole fagocitiche contenenti proteine cellulari o organelli, svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell'omeostasi cellulare e di vari processi metabolici1. Man mano che la conoscenza dell'autofagia si approfondisce, i ricercatori hanno scoperto che le vescicole autofagiche possono colpire selettivamente organelli, proteine o agenti patogenispecifici 2. La xenofagia si riferisce al processo mediante il quale le cellule riconoscono selettivamente i patogeni intracellulari attraverso l'autofagia e li consegnano ai lisosomi per l'eliminazione3. Questo processo è fondamentale per il meccanismo di difesa del sistema immunitario innato negli organismi eucarioti4. Di conseguenza, chiarire i suoi meccanismi e la sua regolazione è un'area essenziale di ricerca, con implicazioni significative per lo sviluppo di nuove strategie anti-infettive.
La Legionella pneumophila è un patogeno intracellulare Gram-negativo che di solito infetta i protisti unicellulari acquatici. Tuttavia, gli esseri umani possono sviluppare infezioni opportunistiche dal contatto con acqua contaminata, portando alla malattia del legionario, una grave forma di polmonite5. Entrando nella cellula ospite, la Legionella impiega il sistema di secrezione di tipo IV (T4SS) per trasportare circa 330 proteine effettrici, aiutando nell'evasione della risposta immunitaria dell'ospite e garantendo la sopravvivenza e la proliferazione batterica all'interno delle cellule. La legionella, come la Salmonella, ostacola la xenofagia dell'ospite utilizzando proteine effettrici, anche se il meccanismo molecolare preciso deve ancora essere stabilito6. Ad esempio, Salmonella Typhimurium rilascia effettori di secrezione di tipo III (ad esempio, SopF) che ADP-ribosilano la V-ATPasi vacuolare e bloccano l'inizio dell'autofagia7, mentre L. pneumophila utilizza il T4SS ed effettori come RavZ e SidE per interferire con gli stadi successivi della xenofagia 6,8. Nonostante queste diverse tattiche, entrambi i patogeni alla fine eludono la clearance xenofagica, evidenziando strategie convergenti nell'evasione dell'autofagia. Pertanto, lo studio di queste proteine di virulenza non solo contribuisce allo sviluppo di terapie antinfettive specifiche, ma ha anche il potenziale per far luce sulle complessità molecolari della xenofagia.
Meccanismi della xenofagia nell'eliminazione dei patogeni
Nel 1984, Rikihisa et al. hanno fatto una scoperta significativa che i neutrofili infettati da Rickettsia producono autofagosomi, segnando il primo caso di coinvolgimento dell'autofagia nelle infezioni batteriche9. Ulteriori studi hanno scoperto che l'induzione dell'autofagia nei macrofagi attraverso la rapamicina provoca la co-localizzazione delle proteine LC-3 e Beclin-1 correlate all'autofagia con le vescicole contenenti Mycobacterium tuberculosis , prevenendo la proliferazione batterica all'interno delle cellule10. Inoltre, è noto che patogeni intracellulari come Salmonella typhi, Listeria, Shigella flexneri e Burkholderia mallei inducono l'autofagia, che successivamente controlla la loro crescita all'interno delle cellule ospiti11.
La xenofagia, una forma di autofagia selettiva, comprende tre processi distinti: il riconoscimento del carico, il reclutamento del recettore dell'autofagia e la degradazione mediata dai lisosomi (come illustrato nella Figura 1). Tuttavia, il meccanismo con cui le cellule riconoscono i patogeni invasori (riconoscimento del carico) e avviano l'autofagia rimane poco chiaro. Gli studi suggeriscono che quando i batteri si infiltrano nel citoplasma, l'ubiquitina ligasi attacca l'ubiquitina ai vacuoli infettati da agenti patogeni o alle proteine presenti sulla superficie dei patogeni 12,13,14. Queste proteine marcate si assemblano quindi in un rivestimento di ubiquitina, racchiudendo il patogeno e fungendo da piattaforma di segnalazione per il reclutamento di adattatori per autofagia, tra cui principalmente p62/SQSTM1, NDP52, NBR1 e optineurina. Gli adattatori per autofagia facilitano la xenofagia interagendo con le proteine attraverso il dominio di interazione con LC3 (LIR), oltre al dominio di legame dell'ubiquitina (UBD) che media il legame delle proteine ubiquitinate15. Ad esempio, le ligasi E3 ospiti come LRSAM1 e Parkin legano l'ubiquitina ai batteri invasori, generando così il segnale del rivestimento di ubiquitina che li segnala per l'eliminazione xenofagica16,17. Inoltre, i recettori della xenofagia possono anche avviare la xenofagia legandosi alla galectina sulla superficie del fagosoma batterico o interagendo direttamente con le proteine della superficie batterica18,19. Un'altra prospettiva propone che i batteri all'interno del fagosoma possano alterare i gradienti ionici della vescicola danneggiando la membrana, portando a cambiamenti conformazionali nelle V-ATPasi sulla membrana fagosomiale, che reclutano il complesso Atg5-Atg12-Atg16L1 attraverso il legame al dominio WD40 di ATG16L1 7,20. ATG16L1 possono anche legarsi al complemento C3 che riveste i batteri inghiottiti attraverso il suo dominio WD40, reclutando il complesso Atg5-Atg12-Atg16L1 nel fagosoma batterico21. Non è chiaro se questi diversi meccanismi di riconoscimento abbiano come bersaglio specie batteriche distinte o se si verifichino in diversi stadi dell'infezione. Sono necessarie ulteriori ricerche ed esplorazioni per comprendere appieno questi meccanismi.
Strategie dei patogeni per eludere la xenofagia
Durante la co-evoluzione con il loro ospite, i patogeni intracellulari hanno sviluppato vari meccanismi per inibire la xenofagia 22,23,24. Ciò si traduce in una debole risposta xenofagica durante le infezioni, rendendo difficile l'osservazionedi 25. Ad esempio, lo streptococco beta-emolitico secerne una proteasi di cisteina chiamata SpeB che prende di mira p62, NDP52 e NBR1 per la degradazione. I mutanti con delezione di SpeB non erano in grado di resistere all'autofagia e la loro crescita all'interno delle cellule era soppressa. Questi risultati confermano il ruolo essenziale di questi adattatori per autofagia nella xenofagia. È stato scoperto che la proteina di virulenza VirG di Shigella flexneri induce la xenofagia reclutando Atg5 sulla superficie batterica19. Tuttavia, il batterio impiega anche il sistema di secrezione di tipo III per trasportare la proteina effettrice IcsB, che inibisce il legame di ATG5 a VirG19. Di conseguenza, si impedisce che si verifichi l'autofagia19. Questa competizione tra le proteine batteriche e il meccanismo dell'autofagia suggerisce che le proteine Atg possono riconoscere direttamente le proteine di superficie batteriche per avviare la xenofagia. Allo stesso modo, la proteina di virulenza CpbC di Streptococcus pneumoniae induce la degradazione autofagica di Atg14 formando un complesso p62-CpbC-Atg14, che a sua volta diminuisce il livello di Atg14. Ciò influisce sul complesso Atg14-STX17, che media l'interazione lisosomia, inibendo così la xenofagia26.
In uno studio che utilizza la Salmonella come batterio modello, Xu et al. hanno scoperto che il danno alla vescicola di membrana causato dall'infezione viene rilevato dalla V-ATPasi, che porta all'attivazione della xenofagia attraverso il legame al dominio WD40 di ATG16L17. Questa attivazione non fa parte della tipica via dell'autofagia. Inoltre, la proteina di virulenza SopF ha la capacità di mediare l'ADP-ribosilazione (ADPRilazione) delle V-ATPasi e di inibire la loro capacità di avviare la xenofagia7. Ciò illustra come i batteri e le loro proteine di virulenza secrete possano essere utilizzati come strumenti preziosi per indagare e comprendere il complesso fenomeno e i meccanismi dell'autofagia, che sono spesso difficili da esplorare in normali condizioni fisiologiche.
Legionella e xenofagia
L. pneumophila stabilisce una nicchia replicativa chiamata vacuolo contenente Legionella (LCV) manipolando attività biologiche essenziali come l'ubiquitinazionedell'ospite 27, il trasporto delle vescicole28, il metabolismo energetico29 e la motilità cellulare30. Nonostante la presenza di numerose proteine ubiquitinate all'interno dei batteri intracellulari31, la Legionella ha sviluppato vari meccanismi per contrastare l'autofagia, impedendo la fusione dell'LCV con i lisosomi 6,8.
RavZ inibisce l'autofagia scindendo LC3-II
La prima proteina effettrice della Legionella trovata per regolare l'autofagia è RavZ (Lpg1683). Come cisteina proteasi, RavZ scinde il legame ammidico tra la glicina carbonio-terminale e il precedente residuo amminoacidico di LC3, portando a una compromissione irreversibile della lipidazione di LC38. Rispetto alla Legionella wild-type, il ceppo mutante con delezione RavZ (ΔravZ) ha mostrato un aumento significativo dei livelli di LC3-II e del numero di punti LC3 nelle cellule ospiti dopo l'infezione8. Un ceppo di Listeria geneticamente modificato (ΔhlyΔ prfAcLLO) può innescare una forte risposta xenofagica all'ingresso nelle cellule. Quando co-infetta le cellule, la Legionella wild-type può sopprimere l'accumulo di LC3 attorno al ceppo ΔhlyΔ prfAcLLO, ma ΔravZ perde la sua capacità di inibire l'induzione della xenofagia6 da parte del ceppo. Inoltre, l'espressione transitoria di RavZ nelle cellule ospiti inibisce l'autofagia indotta dalla fame8. Questi risultati suggeriscono che RavZ esercita un ampio effetto trans-agente (cioè agisce diffusamente nel citosol) per antagonizzare l'autofagia. Sorprendentemente, la replicazione del mutante ΔravZ non è stata influenzata nelle cellule ospiti e non c'è stato alcun reclutamento apparente di LC3 sulla membrana LCV contenente il mutante ΔravZ 6,8. Questi risultati suggeriscono che la Legionella può utilizzare altre proteine effettrici, oltre a RavZ, per eludere la xenofagia dell'ospite.
Famiglia SidE e xenofagia
La famiglia SidE è composta da quattro proteine omologhe di dimensioni superiori a 170 kDa, denominate SdeA, SdeB, SdeC e SidE32. Queste proteine di virulenza sono strutturalmente simili con ridondanza funzionale, tutte contenenti un dominio mono ADP-ribosiltransferasi (mART) e un dominio fosfodiesterasi (PDE). Gli studi hanno scoperto che in assenza dell'enzima attivante l'ubiquitina (E1) e dell'enzima coniugato con l'ubiquitina (E2), la famiglia SidE funziona come un'ubiquitina ligasi indipendente (E3), catalizzando la modifica unica dell'ubiquitinazione fosforibosilica (PR-Ub) dei substrati 33,34,35. Questo processo avviene in due fasi. Prendendo come esempio SdeA, in primo luogo, SdeA modifica il residuo Arg42 di ubiquitina (Ub) con il gruppo adenosina difosfato ribosio (ADPR) derivato da NAD+ utilizzando il suo dominio mART, generando un prodotto intermedio di ADPR-Ub33,36. Quindi, il legame fosfodiestere di ADPR-Ub viene scisso dal dominio PDE funzionale di SdeA, con conseguente rilascio di AMP e connessione di PR-Ub con il residuo di serina della proteinasubstrato 36.
La famiglia SidE ha numerosi substrati proteici eucariotici. Oltre a mediare l'ubiquitinazione fosforibosilica di GTPasi come Rab1A, Rab6A e Rab33B per interferire con il trasporto vescicolare33,37, studi recenti hanno scoperto che la famiglia SidE ha anche funzioni antagoniste contro la xenofagia 6,38,39,40. Rispetto alla Legionella wild-type, i ceppi mutanti privi dei geni codificanti della famiglia SidE (ΔsidE) mostrano un aumento significativo del reclutamento di p62 sull'LCV6. A differenza di RavZ, che agisce in trans, la famiglia SidE lavora in cis (agendo localmente presso l'LCV) per proteggere il vacuolo della Legionella dalla xenofagia. La legionella che trasporta le proteine della famiglia SidE non può sopprimere il reclutamento di p62 attorno ai ceppi di Listeria 6 co-infettati da ΔhlyΔprfAcLLO. Simile al ceppo ΔravZ, il mutante ΔsidEs può anche eludere la xenofagia dell'ospite. Il meccanismo con cui SidE antagonizza la xenofagia non è chiaro e può essere correlato alla sua interferenza con il sistema di ubiquitinazione dell'ospite mediata dall'ubiquitinazione del fosforibosil. Ad esempio, la fosforibosilazione dell'ubiquitina da parte di SidE potrebbe impedire il riconoscimento dell'LCV da parte dei recettori leganti l'ubiquitina, bloccando così il reclutamento di adattatori come NDP52 o optineurina nel vacuolo.
Altri effettori impegnati nella xenofagia
Oltre a RavZ e SidE, L. pneumophila codifica per altri effettori, tra cui LpSpl, Lpg1137 e Lpg2936, che mirano a vari stadi della via dell'autofagia. LpSpl è un enzima secreto che imita la sfingosina-1-fosfato liasi, scindendo la sfingosina-1-fosfato (S1P) in metaboliti41. Questa deplezione di S1P da parte di LpSpl previene l'accumulo di sfingosina e provoca l'attivazione di mTORC1, inibendo così l'inizio dell'autofagia41. Lpg1137 è una proteasi che scinde la proteina SNARE Syntaxin 17 (Stx17), necessaria per la fusione autofagosoma-lisosoma42. Degradando Stx17, Lpg1137 interferisce con la maturazione dell'autofagosoma e blocca la fase finale di fusione della xenofagia42. Lpg2936 è un effettore nucleare che causa modificazioni epigenetiche di geni correlati all'autofagia (come ATG7 e LC3B), portando alla loro ridotta espressione43. Questa sottoregolazione dei componenti fondamentali dell'autofagia inibisce la biogenesi degli autofagosomi a livello trascrizionale43. Tuttavia, si sa poco sui ruoli di LpSpl, Lpg1137 e Lpg2936 nell'infezione da Legionella ; I loro contributi all'evasione della xenofagia in vivo devono ancora essere completamente chiariti.
La Tabella 1 riassume i principali effettori di L. pneumophila coinvolti nella soppressione della xenofagia, i loro bersagli e funzioni e gli stadi della xenofagia che influenzano.
Prospettive future
Permangono incertezze fondamentali che suggeriscono futuri passi concreti. In primo luogo, la gerarchia temporale degli effettori della Legionella che agiscono sulla xenofagia è irrisolta (LpSpl/mTORC1 precoce contro RavZ medio/tardivo, SidE); in secondo luogo, diversi effettori autofagizzanti (ad esempio, LpSpl, Lpg2936) mancano di validazione in vivo ; In terzo luogo, l'eterogeneità del tipo cellulare delle risposte xenofagiche tra sottogruppi di macrofagi, epitelio e neutrofili è scarsamente mappata. Proponiamo atlanti di infezioni risolte nel tempo (pulse-chase, lipidomica LC3, proteomica PR-ubiquitina, live reporter) per ordinare azioni effettrici; ceppi effettori-delezioni accoppiati (ΔravZ/ΔsidE/ΔlpSpl/Δlpg2936) in modelli murini specifici per tipo di cellula per stabilire la causalità; e multi-omiche a singola cellula/spaziale più CRISPR/perturb-seq focalizzato sull'asse V-ATPasi-ATG16L1, marcatura LRSAM1/Parkin e moduli adattatori (OPTN/NDP52/p62). Dal punto di vista della traduzione, immaginiamo inibitori diretti agli effettori che bloccano RavZ (sito attivo della cisteina proteasi) o SidE (ubiquitinazione mART/PDE PR) per ripristinare i pool di LC3-II e il reclutamento dell'adattatore sull'LCV, insieme a booster diretti all'ospite che migliorano il cargo tagging (attivano LRSAM1/Parkin), stabilizzano l'impegno dell'adattatore-LC3 e regolano transitoriamente il flusso (attivazione di TFEB, mTORC1 moderato). La somministrazione mirata ai polmoni (ad esempio, nanoparticelle inalate che combinano un agente anti-RavZ/SidE con un agonista TFEB) deve essere valutata mediante letture risolte nel tipo di cellula con timestamp (flusso LC3, occupazione PR-Ub, reclutamento dell'adattatore, metriche di fusione) e l'efficacia in vivo (carica batterica, patologia, sopravvivenza).
L. pneumophila ha sviluppato una serie impressionante di strategie per eludere la xenofagia, principalmente attraverso le sue diverse proteine effettrici che interferiscono con il riconoscimento del carico, l'ubiquitinazione, la maturazione degli autofagosomi e la fusione lisosomiale. Questi meccanismi non solo consentono al patogeno di sopravvivere e replicarsi all'interno delle cellule ospiti, ma rivelano anche nuovi aspetti della regolazione dell'autofagia. La comprensione di queste tattiche di evasione fornisce preziose informazioni sulla complessa interazione tra la difesa dell'ospite e l'adattamento microbico. La ricerca futura dovrebbe concentrarsi sull'identificazione di ulteriori effettori, sul chiarimento dei loro bersagli molecolari e sul chiarimento della loro regolazione temporale durante l'infezione. Inoltre, sfruttare queste intuizioni meccanicistiche potrebbe guidare lo sviluppo di terapie dirette all'ospite o di nuovi agenti antimicrobici che ripristinano la funzione della xenofagia. La continua integrazione di imaging avanzato, biologia strutturale e approcci omici sarà cruciale per sezionare le interazioni dinamiche tra L. pneumophila e il meccanismo dell'autofagia, portando potenzialmente a strategie innovative per combattere i patogeni intracellulari.
Infine, molti effettori della Legionella sono multifunzionali e influenzano più processi dell'ospite oltre l'autofagia. Gli stessi effettori che aiutano L. pneumophila a eludere la xenofagia possono anche modulare la morte delle cellule ospiti (apoptosi) e le vie di segnalazione immunitaria, promuovendo ulteriormente la sopravvivenza batterica 23,30,35,44,45. Questo crosstalk tra l'evasione dell'autofagia e altri meccanismi di difesa dell'ospite sottolinea la necessità di studiare le tattiche di virulenza della Legionella in modo olistico. Esplorare come gli effettori mirati all'autofagia influenzano simultaneamente l'apoptosi e l'infiammazione fornirà una comprensione più completa delle interazioni ospite-patogeno e potrebbe rivelare nuovi bersagli per l'intervento terapeutico.
Figura 1: Rappresentazione schematica del meccanismo della xenofagia. Quando i batteri invadono il citoplasma, l'ubiquitina viene coniugata dall'ubiquitina ligasi alle proteine presenti sulla superficie dell'agente patogeno o ai vacuoli infettati dall'agente patogeno, seguita dalla formazione di un rivestimento di ubiquitina che racchiude l'agente patogeno. Questo rivestimento di ubiquitina funge da piattaforma di segnalazione per il reclutamento di adattatori per l'autofagia. Inoltre, i recettori dell'autofagia possono avviare la xenofagia legandosi alla galectina superficiale del fagosoma batterico o interagendo direttamente con le proteine della superficie batterica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Effettore (gene) | Obiettivo/Funzione | Presa di mira la fase della xenofagia | Referenze |
| RavZ (lpg1683) | Cisteina proteasi che scinde LC3-II, rimuovendo l'ancora di membrana (PE) di LC3. | Maturazione dell'autofagosoma (previene la lipidazione di LC3 e il completamento dell'autofagosoma) | 8 |
| Famiglia SidE SdeA/SdeB/SdeC/SidE | Attività dell'ubiquitina ligasi tramite fosforibosil-ubiquitinazione delle proteine dell'ospite; esclude gli adattatori dipendenti dall'ubiquitina (ad es. p62) dalla superficie dei veicoli commerciali leggeri. | Fase di riconoscimento del carico (inibisce la formazione del rivestimento di ubiquitina e il reclutamento dell'adattatore nel vacuolo batterico) | 6,38-40 |
| LpSpl | Sfingosina-1-fosfato liasi mimic; degrada S1P, causando l'attivazione di mTORC1 e bloccando l'inizio dell'autofagia. | Iniziazione (riduce la formazione di autofagosomi a causa dell'attivazione di mTORC1) | 41 |
| LPG1137 | Proteasi che scinde la sintassina 17 (Stx17), uno SNARE necessario per la fusione autofagosoma-lisosoma. | Maturazione dell'autofagosoma (previene la fusione autofagosoma-lisosoma) | 42 |
| LPG2936 | Effettore nucleare che induce il silenziamento epigenetico dei geni dell'autofagia (es. ATG7, LC3B), abbassandone l'espressione. | Iniziazione (compromette la produzione di macchinari per l'autofagia a livello trascrizionale) | 43 |
Tabella 1: Strategie di evasione della xenofagia degli effettori di L. pneumophila. Questa tabella elenca le proteine effettrici selezionate di L. pneumophila, i loro bersagli o attività molecolari e lo stadio della via della xenofagia che interrompono.
Questa revisione esplora il modo in cui la Legionella pneumophila elude la xenofagia, evidenziando i meccanismi mediati dagli effettori e le loro implicazioni per la comprensione delle interazioni ospite-patogeno e lo sviluppo di nuove strategie anti-infettive.
Questo studio è stato sostenuto dalla Commissione provinciale per lo sviluppo e la riforma del Jilin nell'ambito della sovvenzione n. 2023C029-7.
