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Filamentous Fungi

2.3: Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

2.10: Water Quality Analysis via Indicator Organisms

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08:58 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba – Università dell’Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz

I funghi sono organismi eucariotici eterotrofici e, ad eccezione dei lieviti, sono aerobici. Sono abbondanti nei terreni superficiali e sono importanti per il loro ruolo nel ciclo dei nutrienti e nella decomposizione della materia organica e dei contaminanti organici. I funghi marciume bianchi (phanerochaete chryosporium) per esempio, (Figura 1) sono noti per degradare gli aromatici.

Figura 1. Marciume bianco su betulla.

Principles

I terreni contengono generalmente milioni di funghi per grammo, quindi il terreno viene in genere diluito utilizzando una serie di diluizione. Una serie di diluizione viene effettuata sospendendo una data quantità di terreno in una soluzione dispersiva, come l’acqua deionizzata. Le aliquote delle sospensioni vengono quindi trasferite in soluzione fresca, fino a quando la sospensione non viene diluita sufficientemente da consentire alle singole colonie fungine discrete di crescere sulle piastre di agar. (Figura 2)

Dopo l’inoculazione su diverse piastre di agar replicate, le piastre vengono incubate a 25 °C. Dopo che le colonie fungine macroscopiche si sono formate, vengono contate, come mostrato nella Figura 3. Poiché l’ipotesi è che una colonia fungina sia derivata da un organismo, il termine Unità formanti colonie (CFU) viene utilizzato in analisi finale, con i risultati espressi in termini di CFU per grammo di terreno secco del forno.

I normali conteggi fungini coltivabili dal terreno fertile sono nell’intervallo di 10⁶^{-10 6}“propaguloli” fungini (spore, ife o frammenti ifali) per grammo di terreno asciutto. I conteggi delle piastre coltivabili sono stati utilizzati per enumerare gli organismi dal diciannovesimo secolo. Continuano ad essere utilizzati oggi, in quanto sono poco costosi da eseguire, richiedono poco lavoro, sono veloci e sono abbastanza riproducibili. Tuttavia, soffrono di una serie di errori, che devono essere considerati quando si valutano i risultati. Il più significativo di questi errori è il fatto che molti organismi non si svilupperanno su piastre di supporto.

Figura 2. Tecnica di diluizione e placcatura. Qui, la sospensione del terreno diluito viene incorporata direttamente nel mezzo agar piuttosto che essere applicata in superficie come nel caso della placcatura diffusa. Da Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed., Academic Press, San Diego, CA

Figura 3. Funghi del suolo isolati da un terreno superficiale coltivato in una capsula di Petri contenente Rose Bengal Agar. Foto per gentile concessione di K.L. Josephson. Da Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed., Academic Press, San Diego, CA.

Procedure

1. Preparazione del campione di terreno

In primo luogo, determinare il contenuto di umidità iniziale del terreno mediante essiccazione notturna di una quantità nota di terreno umido e ripesatura del terreno essiccato. L’equazione per determinare il contenuto di umidità iniziale del terreno è:

(Equazione 1)
dove:
MC = contenuto di umidità
W = peso netto
D = peso a secco
Calcola la quantità di acqua che deve essere aggiunta a 25 g di terreno per aumentare il contenuto di umidità del suolo al 10% su una base di peso secco.
Quindi, aggiungi quella quantità di acqua a 25 g di terreno.
Coprire il contenitore con pellicola trasparente e forare il film più volte con una sonda per consentire l’aerazione durante l’incubazione. Fissare il film con un elastico.
Pesare il terreno e avvolgere, quindi incubare il campione a temperatura ambiente per una settimana.

2. Inoculazione e incubazione di funghi

Al termine dell’incubazione, pesare il campione di terreno con l’involucro e l’elastico. Calcola la perdita di peso dovuta alla perdita di umidità.
Calcola il nuovo contenuto di umidità del suolo.
Quindi, preparare una serie di diluizione 1/10 dei terreni come mostrato nella Figura 2. Ciò comporterà diluizioni di 10^-1 (bottiglia A), 10^-2(tubo B), 10^-3(tubo C), 10^-4 (tubo D) e 10^-5 (tubo E) g di terreno per mL di sospensioni.
Preparare piatti sterili di agar Rose Bengal-streptomycin. Sia il Rose Bengal che la streptomicina inibiscono la crescita batterica. Per terreni molto fertili dove le popolazioni microbiche del suolo sono elevate, le diluizioni scelte dovrebbero essere più alte, cioè10^-3,10^-4e 10^-5,g di terreno per piatto.
A ciascuna delle 10^-3 piastre, aggiungere 0,1 ml dal tubo di diluizione 10^-2e distribuire sulla superficie dell’agar utilizzando uno spandi vetro sterilizzato a fiamma di etanolo. Poiché una quantità di 0,1 ml è placcata, questo rende la diluizione effettiva 10^-3. Ripetere questi passaggi per tutte le diluizioni.
Incubare le piastre a temperatura ambiente per una settimana.

3. Conteggio delle colonie ed esame al microscopio

Fai in modo che le colonie contino a una e una sola diluizione di ciascun terreno. Le piastre che vengono contate dovrebbero avere colonie numerabili discrete. I piatti troppo cresciuti non dovrebbero essere contati. Allo stesso modo, le piastre con meno di 10 colonie non dovrebbero essere contate. Nota e descrivi le caratteristiche culturali di tre diverse colonie.
Preparare i supporti a nastro a pressione (nastro trasparente) su vetrini per lo studio dettagliato del microscopio utilizzando la seguente procedura:
1. Depositare una goccia di liquido di montaggio lattofenolo al centro di un vetrino pulito
2. Tagliare una striscia di nastro di cellophane trasparente lunga circa 3 cm dal rotolo di scorta. Per evitare di contaminare la superficie adesiva, utilizzare una pinetta durante la manipolazione del nastro. Un ago di dissezione aiuterà a liberare il nastro dalla pinzetta.
3. Il lato adesivo del nastro viene applicato sulla superficie di una colonia di funghi sporulanti. Fare attenzione ad evitare una pressione eccessiva sul nastro o una massa troppo densa di ife e spore verrà raccolta.
4. Rimuovere il nastro dal contatto con la colonia di funghi e applicarlo, lato adesivo verso il basso, alla goccia di fluido di montaggio sul vetrino. Strofinare delicatamente il nastro con uno strumento liscio e piatto per esprimere bolle d’aria.
5. Esaminare il supporto del nastro microscopicamente sotto l’obiettivo di immersione dell’olio con olio.
6. Identificare due diversi generi fungini utilizzando la chiave di identificazione fungina fornita (Figura 4).

Figura 4. Chiave di identificazione fungina.

I funghi filamentosi sono organismi eucariotici multicellulari che si trovano spesso in gran numero nel suolo, svolgendo un ruolo importante nell’ecosistema. I funghi possono essere isolati, quantificati ed esaminati in laboratorio.

I funghi sono abbondanti nei terreni superficiali e svolgono ruoli importanti nel ciclo dei nutrienti e nella decomposizione della materia organica e dei contaminanti. Non essendo in grado di sintetizzare il proprio cibo sono classificati come eterotrofi e sono aerobici e quindi richiedono ossigeno.

Per la coltura di funghi, i campioni di terreno vengono diluiti a concentrazioni note in acqua sterile, quindi placcati su piastre di agar e incubati. Le colonie fungine risultanti possono quindi essere contate e identificate.

Questo video illustrerà i principi alla base dell’isolamento, della quantificazione e dell’identificazione dei funghi filamentosi.

I terreni contengono generalmente milioni di funghi per grammo; pertanto, le diluizioni seriali sono comunemente utilizzate per preparare campioni di terreno per l’analisi. Una data quantità di terreno viene aggiunta a una soluzione disperdente. Le aliquote della sospensione vengono trasferite in una soluzione tampone in serie fino a quando la sospensione non viene diluita abbastanza da consentire la crescita di colonie fungine discrete.

Queste diluizioni vengono poi placcate su mezzi di agar e incubate. Una volta che hanno formato colonie fungine visibili, possono essere contati. Poiché si presume che ogni colonia fungina sia derivata da un singolo organismo, il termine Unità formanti colonie, o CFU, viene utilizzato per esprimere il numero di organismi calcolato per grammo di terreno asciutto.

La maggior parte dei funghi cresce come ife, che sono strutture lunghe e ramificate che sono la principale modalità di crescita vegetativa. Le aggregazioni di ife sono indicate come micelio. I funghi possono anche esistere come organismi unicellulari, con il lievito che è un esempio ben noto.

La riproduzione fungina può avvenire in uno dei diversi modi. I funghi che producono ife possono riprodursi asessualmente, frammentando le ife o da gambi con spore simili a semi. I funghi unicellulari possono riprodursi asessualmente per gemma.

I funghi possono anche riprodursi sessualmente. Questo è meno comune della riproduzione asessuata e di solito si verifica in risposta a condizioni ambientali sfavorevoli. Nei funghi che producono ife, due ife riproduttive di diversi ceppi fungini possono fondersi, creando uno zigote. Nei funghi unicellulari, due cellule di ceppi opposti si fonderanno.

I terreni fertili contengono normalmente nell’intervallo di^{10 6} “propaguloli” fungini per grammo di peso secco. I propaguloli sono spore fungine, ife o frammenti ifali. L’utilizzo di conteggi di piastre coltivabili è una tecnica rapida, economica e riproducibile per chiarire il contenuto fungino. Tuttavia, i risultati possono essere distorti dal fatto che non tutti gli organismi si svilupperanno su piastre di supporto.

Le piastre di agar rosa-Bengala con antibiotici, come la streptomicina, sono tipicamente utilizzate per le colture fungine. Poiché i batteri sono molto più numerosi dei funghi nella maggior parte dei terreni, il mezzo fungino ideale selezionerà contro la crescita batterica consentendo ai funghi di sopravvivere. Il colorante Rosa-Bengala inibisce la crescita della maggior parte dei batteri e riduce le dimensioni delle colonie fungine. Questo è l’ideale e previene la crescita eccessiva di piastre fungine e controlla i batteri.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base della coltivazione di funghi filamentosi, diamo un’occhiata a come questo viene effettuato in laboratorio.

Una volta raccolti i campioni di terreno, portarli in laboratorio per l’analisi. Innanzitutto, calcola il contenuto di umidità del terreno. Aggiungere acqua deionizzata per portare il contenuto di umidità al 15%.

Coprire i contenitori con pellicola trasparente e fissare con un elastico per limitare l’evaporazione. Forare il film più volte per consentire l’aerazione.

Pesare il campione di terreno e il contenitore e registrare. Incubare a temperatura ambiente per una settimana per consentire la crescita dei funghi presenti in natura.

Ripresare i campioni di terreno e il contenitore e registrare il peso. Calcola la perdita di peso dovuta alla perdita di umidità durante la settimana. Aggiungere acqua al terreno, per riportare il peso al valore originale.

Aggiungere 10 g di terreno umido a 95 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente. Questa è la diluizione^{10 -1} poiché 10 g di terreno hanno un volume di circa 5 ml. Eseguire quattro diluizioni seriali da 1 mL in spazi vuoti da 9 mL utilizzando l’acqua di questa soluzione stock.

Quindi, raccogliere otto piastre sterili di agar Rose-Bengal-streptomycin. A due delle piastre, aggiungere 0,1 ml dal tubo di diluizione 10^-2e distribuire sulla superficie dell’agar utilizzando uno spandi vetro sterilizzato a fiamma di etanolo. Poiché una quantità di 0,1 ml è placcata, questo rende la diluizione effettiva 10^-3.

Incubare queste piastre in un armadio buio a temperatura ambiente, per una settimana.

Dopo una settimana, contare le colonie discrete su ogni piatto. Le piastre con 10-20 colonie fungine dovrebbero essere contate. Nota e descrivi le caratteristiche distintive delle piastre o delle colonie.

Prendi un vetrino per microscopio di vetro pulito e deposita una goccia di liquido di montaggio del lattofenolo al centro. Usando una pinna per evitare la contaminazione, tagliare una striscia di nastro di cellophane trasparente lunga circa 3 cm. Se necessario, utilizzare un ago di dissezione per liberare il nastro dalla pinzetta.

Applicare il lato adesivo del nastro sulla superficie di una colonia di funghi sporulanti, avendo cura di evitare una pressione eccessiva. Quindi, applicare il lato adesivo del nastro con campione di spore sul fluido di montaggio sul vetrino. Strofinare delicatamente il nastro con uno strumento liscio e piatto per rimuovere le bolle d’aria.

Esaminare il montaggio su nastro sotto un obiettivo ad alta potenza.

I funghi possono essere identificati microscopicamente dall’esame dei corpi fruttiferi e delle spore. Una chiave di identificazione dei funghi può aiutare questo processo. I tipi di funghi comuni osservati includono Penicillium e Aspergillus.

Usando le piastre, i funghi possono essere enumerati usando la stessa tecnica dell’enumerazione batterica.

Identificare e coltivare funghi è utile per una varietà di applicazioni scientifiche.

Industrie come gli impianti di produzione di cellulosa e carta possono utilizzare funghi filamentosi per degradare il legno nel loro processo di polpa, in una tecnica nota come biopulping. Funghi come il marciume bianco possono degradare i trucioli di legno in modo efficiente, portando a una diminuzione della necessità di utilizzare pasta chimica o meccanica.

I funghi possono anche essere utilizzati per abbattere altri materiali, compresi alcuni tipi di plastica biodegradabile. Questo può essere utile per applicazioni agricole o di giardinaggio, dove i film di pacciamatura biodegradabili possono essere utilizzati per creare barriere temporanee alla crescita indesiderata delle piante.

I funghi sono anche produttori di antibiotici, composti che hanno rivoluzionato la medicina nel 20 ° secolo e continuano ad essere una difesa in prima linea nelle infezioni di oggi. La penicillina, un antibiotico ampiamente usato, è stata isolata dai comuni funghi filamentosi Penicillium rubens. Fino ad oggi, i funghi filamentosi sono ancora isolati e studiati nella ricerca di nuovi antibiotici.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE ai funghi filamentosi. Ora dovresti capire come colturare funghi filamentosi dal suolo, come quantificarli e come identificare i tipi di funghi che si trovano comunemente nel suolo. Grazie per l’attenzione!

Results

Conteggi delle colonie

Il numero di colonie fungine per grammo di terreno è pari al numero di colonie contate sulla piastra moltiplicato per il reciproco della diluizione placcata. Ad esempio, se 46 colonie vengono contate a una diluizione di 10^-5, allora il CFU per grammo di terreno è 46 x 10⁵ o 4,6 x 10⁶.

Identificazione di tre diversi generi fungini

I funghi possono essere identificati microscopicamente dall’esame dei corpi fruttiferi e delle spore. Una chiave di identificazione dei funghi può aiutare questo processo. (Figura 4) I tipi di funghi comuni osservati includono Penicillium e Aspergillus.

Applications and Summary

La diluizione e la placcatura dei funghi del suolo possono essere utilizzate come indicazione della salute di un suolo. Normalmente un terreno fertile “sano” avrà da 10⁵ a 10⁶ funghi per grammo di terreno. Può anche essere utilizzato per isolare colture pure di funghi specifici, successivamente valutati per proprietà specifiche, come la capacità di degradare i composti organici. Questi possono essere dannosi come nel caso dei funghi di marciume bianco, o utili quando le sostanze organiche tossiche vengono degradate attraverso la biodegradazione. Altri usi di colture pure di funghi includono l’isolamento di funghi per antibiotici. Ad esempio, il primo antibiotico in assoluto è stata la penicillina, prodotta dal fungo penicilliumtrasmesso dal suolo . Questo fu scoperto per la prima volta da Sir. Alexander Fleming nel 1929.

References

Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).

Transcript

Filamentous fungi are multicellular, eukaryotic organisms often found in large numbers in soil, playing an important role in the ecosystem. Fungi can be isolated, quantified, and examined in the laboratory.

Fungi are abundant in surface soils and perform important roles in nutrient cycling and decomposition of organic matter and contaminants. Being unable to synthesize their own food they are classified as heterotrophic and are aerobic and therefore require oxygen.

To culture fungi, soil samples are diluted at known concentrations into sterile water, then plated onto agar plates and incubated. The resulting fungal colonies may then be counted and identified.

This video will illustrate the principles behind the isolation, quantification, and identification of filamentous fungi.

Soils generally contain millions of fungi per gram; therefore, serial dilutions are commonly used to prepare soil samples for analysis. A given amount of soil is added to a dispersing solution. Aliquots of the suspension are transferred to a buffer solution in series until the suspension is diluted enough to allow discrete fungal colonies to grow.

These dilutions are then plated onto agar media and incubated. Once they have formed visible fungal colonies, they can be counted. As it is assumed that each fungal colony is derived from a single organism, the term Colony Forming Units, or CFU’s, is used to express the number of organisms calculated per gram of dry soil.

Most fungi grow as hyphae, which are long, branching structures that are the main mode of vegetative growth. Aggregations of hyphae are referred to as mycelium. Fungi may also exist as single celled organisms, with yeast being a well-known example.

Fungal reproduction can occur in one of several ways. Hyphae-producing fungi can reproduce asexually, by fragmenting hyphae, or from stalks with seed-like spores. Single-celled fungi may reproduce asexually by budding.

Fungi can also reproduce sexually. This is less common than asexual reproduction, and usually occurs in response to unfavorable environmental conditions. In hyphae-producing fungi, two reproductive hyphae from different fungal strains can fuse, creating a zygote. In single celled fungi, two cells of opposite strains will fuse.

Fertile soils normally contain in the range of 106 fungal “propagules” per gram of dry weight. Propagules are fungal spores, hyphae, or hyphal fragments. Using culturable plate counts is a quick, inexpensive, and reproducible technique to elucidate fungal content. However, results can be skewed by the fact that not all organisms will culture on media plates.

Rose-Bengal agar plates with antibiotics, such as streptomycin, are typically used for fungal cultures. Because bacteria are much more numerous than fungi in most soils, the ideal fungal media will select against bacterial growth while allowing the fungi to survive. Rose-Bengal dye inhibits the growth of most bacteria, and reduces the size of fungal colonies. This is ideal, and prevents overgrowth of fungal plates as well as controlling bacteria.

Now that we are familiar with the principles behind culturing filamentous fungi, let’s take a look at how this is carried out in the laboratory.

Once the soil samples have been collected, bring them to the laboratory for analysis. First, calculate the moisture content of the soil. Add deionized water to bring the moisture content to 15%.

Cover the containers with plastic wrap and secure with a rubber band to limit evaporation. Puncture the film several times to allow aeration.

Weigh the soil sample and container and record. Incubate at room temperature for one week to allow growth of the naturally occurring fungi.

Re-weigh the soil samples and container and record the weight. Calculate weight loss due to moisture loss over the week. Add water to the soil, to bring the weight back to the original value.

Add 10 g of moist soil to 95 mL of distilled water and mix thoroughly. This is the 10-1 dilution since 10 g of soil has a volume of roughly 5 mL. Perform four serial dilutions of 1 mL into 9 mL blanks using water from this stock solution.

Next, collect eight sterile Rose-Bengal-streptomycin agar plates. To two of the plates, add 0.1 mL from dilution tube 10-2, and spread over the agar surface using an ethanol-flame sterilized glass spreader. Because a quantity of 0.1 mL is plated, this makes the effective dilution 10-3.

Incubate these plates in a dark cabinet at room temperature, for one week.

After one week, count the discrete colonies on each plate. Plates with 10 to 20 fungal colonies should be counted.Note and describe distinguishing features of the plates or colonies.

Take a clean glass microscope slide and deposit a drop of lactophenol mounting fluid into the center. Using forceps to avoid contamination, cut a strip of clear cellophane tape about 3 cm long. If necessary, use a dissecting needle to free the tape from the forceps.

Apply the adhesive side of the tape to the surface of a sporulating fungus colony, taking care to avoid excessive pressure. Next, apply the adhesive side of the tape with spore sample to the mounting fluid on the glass slide. Rub the tape gently with a smooth, flat instrument to remove air bubbles.

Examine the tape mount under a high-powered objective.

Fungi can be identified microscopically by examination of the fruiting bodies and spores. A fungi identification key can assist this process. Common fungi types observed include Penicillium and Aspergillus.

Using the plates, the fungi can be enumerated using the same technique as with bacterial enumeration.

Identifying and culturing fungi is useful for a variety of scientific applications.

Industries like pulp and paper producing facilities may use filamentous fungi to degrade wood in their pulping process, in a technique known as biopulping. Fungi such as white-rot may degrade wood chips efficiently, leading to decreased need for the use of chemical or mechanical pulping.

Fungi can also be used to break down other materials, including certain types of biodegradable plastics. This can be useful for agricultural or gardening applications, where biodegradable mulch films may be used to create temporary barriers to unwanted plant growth.

Fungi are also producers of antibiotics, compounds that revolutionized medicine in the 20th century and continue to be a front line defense in infection today. Penicillin, a widely used antibiotic, was isolated from the common filamentous fungi Penicillium rubens. To this day, filamentous fungi are still isolated and studied in the search for new antibiotics.

You’ve just watched JoVE’s introduction to filamentous fungi. You should now understand how to culture filamentous fungi from soil, how to quantify them, and how to identify types of fungi commonly found in soil. Thanks for watching!