Astinenza di sangue II

Blood Withdrawal II

JoVE Science Education
Lab Animal Research

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Blood Withdrawal II

5.7: Compound Administration II

5.14: Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest

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12:27 min

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August 24, 2015

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

La raccolta di sangue da topi e ratti per l’analisi può essere effettuata attraverso una varietà di metodi. Ogni metodo di raccolta ha variazioni nel tipo di ritenuta richiesta, nell’invasività della procedura e nella necessità di un anestetico generale. ¹ Storicamente, l’uso della cavità del seno retro-orbitale è stato usato, ma non senza dibattito. La controversia relativa al potenziale danno tissutale, o addirittura alla cecità, causato da sanguinamenti retro-orbitali ha portato allo sviluppo di metodi di sanguinamento delle vene facciali e sottomandibolari nei topi. La raccolta di sangue dalla vena safena sia nei topi che nei ratti è un’altra tecnica che è stata sviluppata. Queste procedure non richiedono anestesia e quindi sono adatte quando l’uso di anestetici può confondere i risultati del sangue o altri dati.

Principles

C’è una vena facciale nel topo che corre dal plesso oculare attraverso la guancia e una vena sottomandibolare che corre lungo la mascella inferiore. Entrambi i vasi convergono nella vena giugulare appena sotto la linea della mascella, rendendoli facilmente accessibili. I campioni seriali possono essere prelevati da entrambe le navi alternando il lato utilizzato. Tuttavia, nessuna delle due parti dovrebbe essere usata più spesso di ogni 5-7 giorni. ²

È necessario prendere precauzioni durante l’esecuzione di un sanguinamento della vena facciale. Poiché il condotto uditivo si trova vicino alla vena facciale, se la punta della lancetta è diretta caudale, il canale verrà perforato. Ciò si tradurrà in un effetto sifone che causa il sangue a venire dall’orecchio. Nonostante questo, il sangue può ancora essere raccolto e il topo non subirà alcun danno permanente. Tuttavia, questo può far sì che l’animale scuota la testa, schizzando sangue nella gabbia.

Quando si sanguina dalla vena sottomandibolare, la profondità di inserimento dell’ago è fondamentale. Una profondità di inserimento superiore a 4-5,5 mm può causare traumi ai muscoli, ai nervi e ad altri vasi che si trovano nella testa, nel collo e nella cavità orale. Le complicazioni successive includono un’eccessiva emorragia con conseguente ipovolemia, annegamento causato dal fluido in bocca e danni alle strutture orali che interferiscono con mangiare e bere.

La moderazione dell’animale è fondamentale per un sanguinamento di successo sia per la vena facciale che per le procedure della vena sottomandibolare. Se la presa sulla collottola è troppo stretta, il flusso di sangue alla vena facciale può essere limitato. Ciò comporterà una riduzione del volume raccolto. I volumi di raccolta variano sia sulla vena facciale che sul sanguinamento della vena sottomandibolare. È imperativo limitare i volumi di raccolta in modo che non superino il volume massimo per la raccolta di sangue di sopravvivenza in conformità con le politiche istituzionali e un protocollo animale approvato. Garantire l’emostasi una volta raccolta la quantità desiderata impedirà una perdita di sangue aggiuntiva o eccessiva. ²

La raccolta di sangue dalla vena safena è un’altra valida alternativa per le emorragie seriali. La vena safena laterale è un vaso superficiale che corre dorsalmente, e poi lateralmente, attraverso l’articolazione tarsale. ³ Sebbene questa procedura possa essere esteticamente più accettabile del sanguinamento retro-orbitale, a causa della preparazione richiesta e dell’uso dell’anestesia per questo metodo, potrebbe effettivamente essere più stressante per l’animale. Le complicazioni che possono derivare da un sanguinamento safeno sono correlate al sito di puntura. Se la puntura dell’ago non è direttamente sulla nave, il sangue può pool in modo sottocutaneo, causando un ematoma. Lividi, possibili infezioni e favore dell’arto sono altri possibili problemi. Questo metodo richiede allenamento, ma è facilmente afferrato. I volumi raccolti con questo metodo sono compresi tra 10-150 μL, a seconda della frequenza di campionamento. ⁴ I campioni sono di qualità variabile in quanto possono contenere prodotti tissue. Non devono essere prelevati più di quattro campioni di sangue entro un periodo di 24 ore dalla stessa gamba.

La vena femorale è un’altra opzione per la raccolta del sangue su un ratto. La vena femorale corre sull’aspetto mediale della zampa posteriore dall’inguine all’articolazione del ginocchio prima di attraversare il ginocchio e diventare il safeno laterale, rendendolo facilmente accessibile. Sebbene questa procedura possa essere eseguita senza l’uso di un anestetico, richiede due persone una persona terrà la gamba nel punto in cui la gamba e l’addome si collegano per occludere la vena, mentre l’altra esegue la venipuntura e raccoglie il sangue.

Il vantaggio di utilizzare la vena femorale è che un volume maggiore viene raccolto più facilmente da esso che dalla vena safena. Tuttavia, poiché la vena femorale è grande, è soggetta alla formazione di ematomi. Questo può essere esacerbato da una presa troppo salda sulla gamba, che può causare ulteriori lividi. Con questo metodo di raccolta del sangue, vi è una variazione nella quantità di sangue raccolto a causa del sanguinamento dopo la rimozione dell’ago. È imperativo garantire l’emostasi per prevenire questa eccessiva perdita di sangue.

Procedure

1. Sanguinamento della vena facciale nei topi

Attrezzatura
1. La raccolta del sangue proviene da una cattura libera in un tubo di sangue o in un tubo di Eppendorf. In alcuni casi, è auspicabile raccogliere il sangue direttamente nei tubi dell’ematocrito.
2. Le lancette della verga d’oro saranno selezionate in base alla dimensione appropriata per l’animale in base all’età e al sesso.
  1. Le lancette sono selezionate in base all’età / dimensione dei topi come segue:
    Lancetta da 4 mm: topi di 3-4 settimane (meno di 15 grammi di peso corporeo)
    Lancetta da 5 mm: topi femmina sotto le 10 settimane (meno di ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Lancetta da 5 mm: topi maschi sotto le 6 settimane (meno di ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Lancetta da 5 mm: per campioni a goccia singola (per strisci di sangue)
    Lancetta da 5,5 mm: topi femmina per 10 settimane (oltre ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Lancetta da 5,5 mm: topi maschi per 6 settimane (oltre ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Lancetta da 5,5 mm: campioni di grandi dimensioni
Limitazione
1. I topi sono trattenuti usando la tecnica dello scruffing.
2. È importante ridurre al minimo il movimento da un lato all’altro della testa. Ciò garantisce una venipuntura accurata e sicura con la lancetta.
Astinenza di sangue
1. La lancetta di dimensioni adeguate è tenuta perpendicolare alla superficie della pelle.
2. La punta della lancetta è leggermente inclinata, con la punta rivolta verso il naso.
3. La lancetta è utilizzata al meglio in posizione verticale.
4. Mentre si trattiene il mouse, individuare l’area approssimativa della vena facciale misurando la lunghezza dell’occhio sotto il canthus laterale e la larghezza dell’occhio caudale.
5. Con la punta della lancetta, senti delicatamente il punto in cui termina la mascella.
6. Per una migliore precisione nella perforazione della nave, posizionare il mouse in posizione laterale.
7. Perfora la pelle fino alla spalla della lancetta a quel punto. Questo viene fatto con una spinta ferma e non come lanciare un dardo.
8. Dopo la rimozione della lancetta, il sangue inizierà a fluire.
9. Per aiutare il flusso sanguigno, posizionare il mouse con la testa più in basso rispetto al cuore.
10. Raccogliere il sangue nel vaso di raccolta desiderato.
11. Tamponare il sito di puntura e rilasciare la pressione sulla collottola per l’emostasi.

Figura 1. Sanguinamento della vena facciale nei topi.

2. Sanguinamento sottomandibolare nei topi: Sebbene molto simile alla tecnica per il sanguinamento della vena facciale, ci sono variazioni nell’attrezzatura e sottili differenze in questa procedura di sanguinamento.

Attrezzatura
1. La raccolta del sangue proviene da una cattura libera in un tubo di sangue o in un tubo di Eppendorf. In alcuni casi, è auspicabile raccogliere direttamente nei tubi dell’ematocrito.
2. Gli aghi calibro 18-22 vengono selezionati in base alle dimensioni appropriate per l’animale in base all’età e al sesso.
  1. Gli aghi sono selezionati in base all’età / dimensione dei topi come segue:
    Calibro 22: topi di 3-4 settimane (meno di 15 grammi di peso corporeo)
    Calibro 20: topi femmina sotto le 10 settimane (meno di ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Calibro 20: topi maschi sotto le 6 settimane (meno di ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Calibro 20: per campioni a goccia singola (per strisci di sangue)
    Calibro 18: topi femmina per 10 settimane (oltre ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Calibro 18: topi maschi per 6 settimane (oltre ~ 20 grammi di peso corporeo)
    Calibro 18: campioni di grandi dimensioni
Limitazione
1. I topi sono trattenuti usando la tecnica dello scruffing.
2. È importante ridurre al minimo il movimento da un lato all’altro della testa. Ciò garantisce una venipuntura accurata e sicura con l’ago.
Astinenza di sangue
1. L’ago è tenuto perpendicolare alla superficie della pelle.
2. Mentre trattenete il mouse, individuare l’area approssimativa della vena sottomandibolare dal punto in cui una linea dall’angolo della bocca interseca una linea dal canthus laterale dell’occhio. Questo coincide con una piccola fossetta glabre trovata caudale all’angolo della bocca e leggermente al di sotto della linea della mascella.
3. Per una migliore precisione nella perforazione della nave, posizionare il mouse in posizione laterale.
4. Forare la pelle con la punta dell’ago in quel punto. Questo viene fatto con una spinta ferma e non come lanciare un dardo.
5. L’ago non viene inserito oltre la punta della smussatura.
6. Dopo la rimozione dell’ago, il sangue inizierà a fluire.
7. Per aiutare il flusso sanguigno, posizionare il mouse con la testa più in basso rispetto al cuore.
8. Raccogliere il sangue nel vaso di raccolta desiderato.
9. Tamponare il sito di puntura e rilasciare la pressione sulla collottola per l’emostasi.

Figura 2. Sanguinamento della vena sottomandibolare nei topi.

3. Sanguinamento safeno

Attrezzatura
1. I coni di ritenuta flessibili in plastica trasparente possono essere utilizzati sia per il topo che per il ratto. Per i topi, i tubi conici in plastica da 50 milliliter modificati possono essere utilizzati per il contenimento. Per i ratti, possono essere utilizzati tubi di ritenuta in plexiglas modificati, con una fessura abbastanza larga da estendere la zampa posteriore.
2. Quando si utilizza il cono di plastica, viene misurato rispetto alla lunghezza del corpo dell’animale e un foro ovale viene tagliato a livello della coscia.
3. Un tubo conico può essere modificato per un topo per questo metodo di raccolta del sangue tagliando l’estremità del tubo per consentire un foro di respirazione. Una fessura viene tagliata dall’estremità del cappuccio del tubo larga circa 1/2 pollice e lunga 2 pollici. I bordi sono coperti con nastro di stoffa o levigati per la sicurezza degli animali.
4. Un laccio emostatico viene prodotto utilizzando una siringa da 3 cc e una lunghezza di sutura non assorbibile 2-0. ³
5. Triplo unguento antibiotico o vaselina bianca viene utilizzato come barriera a prova di umidità sulla pelle.
6. Un ago calibro 22 è la dimensione preferita per la venipuntura.
7. Il sangue viene raccolto direttamente nei tubi dell’ematocrito.
Limitazione
1. Coni flessibili in plastica
  1. Il topo o il ratto viene posto prima nel naso del cono.
  2. L’estremità del cono viene piegata e chiusa utilizzando una piccola clip legante per impedire all’animale di uscire dal cono di ritenuta.
  3. La zampa posteriore viene delicatamente tirata attraverso l’apertura ovale all’inguine.
2. Tubo conico per topi
  1. Il mouse viene posizionato prima nel naso del tubo.
  2. La zampa posteriore viene delicatamente guidata nella fessura.
  3. Il dito medio è posizionato sopra l’estremità del tubo per impedire al mouse di uscire dal tubo.
  4. L’indice e il pollice stabilizzano la gamba del mouse.
3. Tubo di ritenuta in plexiglas per ratti
  1. Il ratto viene posto nel naso del tubo prima.
  2. La zampa posteriore viene delicatamente guidata nella fessura.
  3. L’estremità del tubo è fissata per impedire al ratto di eseguire il backup e uscire dal tubo.
  4. L’indice e il pollice stabilizzano la gamba del ratto.
Astinenza di sangue
1. I peli vengono rimossi dall’aspetto laterale della gamba dal garretto al soffocamento. Questo può essere fatto spennando, radendo o usando una crema depilatoria.
2. Una volta rimossi i capelli, viene applicata una piccola quantità di unguento e distribuita in uno strato molto sottile sulla zona glagra.
3. Il laccio emostatico viene applicato il più cranicamente possibile e stretto.
4. Il vaso safeno che attraversa la superficie esterna della gamba dal ginocchio alla caviglia inizierà a riempirsi e diventerà sollevato e facile da visualizzare.
5. L’ago è tenuto perpendicolare alla superficie della pelle direttamente sopra il vaso sanguigno. Forare la nave. Fare attenzione a non inserire l’ago in profondità nella gamba, per evitare di perforare il muscolo o colpire l’osso.
6. Il sangue verrà permeato sulla superficie della gamba per la raccolta con il tubo dell’ematocrito.
7. Una volta che il sangue è stato raccolto, allentare il laccio emostatico e applicare pressione sulla puntura per l’emostasi.
8. Una volta che il sanguinamento si è fermato, rimuovere l’animale dalla ritenuta e riportarlo nella gabbia di casa.

Figura 3. La vena safena sanguina nei topi.

4. Vena femorale per ratti

Attrezzatura
1. Il sangue viene raccolto in un tubo di ematocrito.
2. Triplo unguento antibiotico è necessario per creare una barriera tra la pelle / capelli e la goccia di sangue.
3. Un ago calibro 22 viene utilizzato per perforare la vena.
4. Un piccolo tagliacapelli portatile con una lama larga circa 1 “viene utilizzato per tagliare i capelli dalla gamba.
Limitazione
1. I ratti sono trattenuti usando un cono di contenimento in plastica trasparente e flessibile.
2. I coni di plastica sono misurati rispetto alla lunghezza del corpo e un foro ovale tagliato a livello della coscia. Il cono è tagliato in modo tale che la zampa posteriore possa essere esternata con accesso alla vena.
Astinenza di sangue
1. I capelli vengono rasati dalla superficie interna della gamba dall’inguine al ginocchio.
2. L’unguento antibiotico triplo viene applicato in uno strato sottile nel sito di puntura.
3. La persona di contenimento occlude la vena e tiene il ratto con la superficie interna della gamba rivolta verso il flebotomista.
4. Utilizzare l’ago per perforare la vena. L’ago viene tenuto perpendicolarmente al vaso sanguigno e la puntura viene eseguita direttamente sulla vena.
5. La puntura viene effettuata il più vicino possibile al ginocchio, consentendo un ulteriore campionamento anteriore al primo sito di raccolta del sangue.
6. La nave è superficiale. Pertanto, la profondità della puntura non deve essere più profonda della lunghezza della smussatura dell’ago.
7. Per aiutare il flusso sanguigno, posizionare il ratto con la gamba più bassa del cuore.
8. Raccogli il sangue nei tubi dell’ematocrito mentre perla sulla superficie della pelle.
9. Rilasciare la pressione sulla gamba e applicare pressione sul sito di puntura per ottenere l’emostasi.

Figura 4. La vena femorale sanguina nei ratti.

La raccolta di sangue da topi e ratti è necessaria per un’ampia varietà di studi scientifici e i ricercatori hanno sviluppato diversi metodi per raggiungere specifici obiettivi sperimentali.

Nella prima puntata, abbiamo discusso la considerazione generale sull’astinenza di sangue e abbiamo esaminato il sanguinamento retro-orbitale dell’occhio, i cecchini e i nick della coda, nonché i metodi di raccolta del sangue intra-cardiaco. Qui, delineeremo le procedure per la raccolta del sangue dalle vene facciali, sottomandibolari, safene e femorali. Questi metodi sono meno invasivi e non richiedono anestesia, il che li rende metodi di scelta quando l’uso di anestetici può confondere i risultati del sangue o altri dati.

Iniziamo con la procedura per ottenere un campione di sangue da una vena facciale murina. Sul mouse, c’è una vena facciale facilmente accessibile che attraversa la guancia. Inizia scegliendo l’attrezzatura appropriata per la procedura. Fondamentalmente, hai bisogno di un piccolo tubo centrifugo per la raccolta del sangue e una lancetta, che è disponibile in diverse dimensioni. La selezione della lancetta corretta dipende dall’età, dal sesso e dal peso corporeo dell’animale e dalle dimensioni del campione da raccogliere. Vedere il protocollo di testo per i dettagli sulla selezione della lancetta.

Inizia la procedura trattenendo l’animale usando la tecnica dello scruffing. Una corretta moderazione riduce al minimo il movimento laterale della testa e aiuta a garantire una venipuntura accurata e sicura con la lancetta. Se la presa è troppo stretta, il flusso sanguigno può essere limitato con conseguente riduzione del volume raccolto. Una volta che l’animale è trattenuto, individuare l’area approssimativa della vena facciale misurando la lunghezza dell’occhio sotto il canthus laterale e la larghezza dell’occhio caudale. Con la punta della lancetta sentire delicatamente il punto in cui termina la mandibola. Per una migliore precisione nella perforazione della nave, è possibile posizionare il mouse su un lato.

Ora, nel sito di inserimento, tenere la lancetta perpendicolare alla superficie della pelle con la punta rivolta leggermente verso il naso. Questo è fondamentale, perché se la punta della lancetta è diretta caudale, il condotto uditivo sarà perforato causando sanguinamento dall’orecchio. Per perforare la vena, applicare una spinta decisa e perforare la pelle fino alla spalla della lancetta. Al momento della rimozione, il sangue inizierà a fluire. Per aiutare il flusso, posiziona l’animale con la testa più bassa del cuore. Per fermare il sanguinamento, tamponare il sito di puntura per ottenere l’emostasi e prevenire un’eccessiva perdita di sangue. Infine, rilasciare la pressione sulla collottola e riportare l’animale nella sua gabbia. Si noti che i volumi di raccolta varieranno, ma è imperativo NON superare il volume massimo per la raccolta di sangue di sopravvivenza. Vedere il protocollo di testo del video Blood Withdrawal One per i dettagli sul volume massimo raccomandato di raccolta. I campioni seriali possono essere prelevati alternando il lato utilizzato. Nessuna delle due parti dovrebbe essere usata più spesso di ogni 5-7 giorni.

Ora esaminiamo il metodo di sanguinamento della vena sottomandibolare. Sebbene questo sia molto simile alla tecnica per il sanguinamento della vena facciale, ci sono variazioni nell’attrezzatura e sottili differenze nella procedura di sanguinamento.

La vena sottomandibolare corre lungo la mascella inferiore del topo e converge con la vena facciale nella vena giugulare. Invece di una lancetta, questo metodo viene eseguito utilizzando aghi. Ma simile alle lancette, la selezione del calibro dell’ago dipende dall’età, dal sesso, dal peso e dalle dimensioni del campione dell’animale – vedi il protocollo di testo per i dettagli.

Per iniziare, scruff l’animale nello stesso modo in cui sanguina la vena facciale in modo che ci sia un movimento minimo da un lato all’altro della testa. Richiamo: una presa eccessivamente stretta può ridurre il volume di raccolta del sangue. Mentre trattenete il mouse, immaginate una linea dall’angolo della bocca attraverso il viso e una linea dal canthus laterale dell’occhio. Il punto di intersezione di queste linee è l’area approssimativa della vena sottomandibolare. Questo coincide con una piccola fossetta glabre trovata caudale all’angolo della bocca e leggermente al di sotto della linea della mascella.

Per una maggiore precisione, posizionare l’animale in posizione laterale (3.6.1). Quindi, tenere l’ago perpendicolare alla superficie della pelle e inserirlo con una spinta decisa. NON inserire l’ago oltre la punta smussata, poiché una profondità di inserimento maggiore di quella può causare traumi ai muscoli, ai nervi e ad altri vasi che si trovano nella testa, nel collo e nella cavità orale. Dopo la rimozione dell’ago, il sangue inizierà a fluire. Come per il sanguinamento della vena facciale, posizionare il mouse con la testa più in basso rispetto al cuore per aiutare con il flusso sanguigno. Infine, tamponare il sito di puntura per ottenere l’emostasi e rilasciare la pressione sulla collottola per riportare l’animale nella sua gabbia.

Ora, impariamo come raccogliere il sangue dalla vena safena. Questa vena è un vaso superficiale che corre dorsalmente e poi lateralmente attraverso l’articolazione tarsale.

L’attrezzatura necessaria per questa procedura include un dispositivo di ritenuta, che potrebbe essere un dispositivo di plastica flessibile per ratti o, per i topi, è possibile utilizzare un tubo conico in plastica da 50 millilitro modificato. Si noti che l’estremità del tubo viene tagliata per consentire un foro di respirazione e una fessura larga mezzo pollice e lunga 2 pollici viene tagliata dall’estremità del cappuccio. I bordi sono coperti da nastro adesivo per la sicurezza degli animali. Questa procedura richiede anche un laccio emostatico – prodotto utilizzando una siringa da 3 cc e una lunghezza di 0-2 sutura non assorbibile, triplo unguento antibiotico con un tampone – da utilizzare come barriera a prova di umidità tra la pelle e la goccia di sangue, un tagliacapelli, un ago calibro 22 per la venipuntura e un tubo ematocrito per la raccolta del sangue.

Per trattenere un topo, posizionalo nel tubo, prima il naso. Quindi, guidare delicatamente la zampa posteriore nella fessura e stabilizzarla usando l’indice e il pollice. Successivamente, radere i capelli dall’aspetto laterale della gamba dal garretto al soffocamento. Quindi, spalmare uno strato molto sottile del triplo unguento antibiotico nell’area glambra. Successivamente, applicare il laccio emostatico il più lontano possibile e stringerlo. Il vaso safeno che attraversa la superficie esterna dal ginocchio alla caviglia inizierà a riempirsi e diventerà sollevato e facile da visualizzare.

Quindi, tenere un ago calibro 22 direttamente sopra il vaso sanguigno e perpendicolare alla superficie della pelle. E perforare la nave, facendo attenzione a non inserire l’ago troppo in profondità e punendo il muscolo o l’osso. Il sangue verrà permeato sulla superficie della gamba per la raccolta in un tubo di ematocrito. Una volta che il sangue è stato raccolto, allentare il laccio emostatico e applicare pressione sulla puntura per l’emostasi. Dopo che l’emorragia si è fermata, rimuovere l’animale dalla ritenuta e riportarlo nella sua gabbia. I volumi raccolti con questo metodo sono compresi tra 10 e 150 μL, a seconda della frequenza di campionamento. E la qualità del campione è variabile, in quanto può contenere prodotti tissue. Non devono essere prelevati più di 4 campioni di sangue entro un periodo di 24 ore dalla stessa gamba.

Infine, impareremo come raccogliere il sangue dalla vena femorale, che è un’altra opzione per la raccolta del sangue su un ratto. La vena femorale corre sull’aspetto mediale della zampa posteriore dall’inguine all’articolazione del ginocchio prima di attraversare il ginocchio e diventare la vena safena laterale, rendendola facilmente accessibile.

Il vantaggio del sanguinamento della vena femorale è che un volume maggiore è più facilmente raccolto rispetto alla vena safena. Lo svantaggio è che questa procedura, in un animale cosciente, richiede due persone. L’attrezzatura necessaria per questa procedura è simile al metodo della vena safena, tranne per il fatto che non richiede il laccio emostatico e il dispositivo di ritenuta preferibile è un cono flessibile. Per selezionare il cono corretto, misuralo rispetto alla lunghezza del corpo dell’animale e quindi fai un foro ovale tagliato a livello della coscia.

Per trattenere l’animale, mettilo nel tubo, prima il naso. Quindi, piegare l’estremità del cono e chiuderlo usando una piccola clip legante per impedire all’animale di uscire. Ora tira la zampa posteriore attraverso l’apertura ovale per accedere alla vena femorale. Non afferrare troppo strettamente in quanto potrebbe esacerbare la formazione di ematoma. Quindi, radere la superficie interna della gamba dall’inguine al ginocchio e applicare un sottile strato di unguento antibiotico triplo all’area glarina. Successivamente, la persona di contenimento dovrebbe occludere la vena femorale e afferrare il ratto con la superficie interna della gamba rivolta verso la persona che sta per prelevare il sangue. Tenendo l’ago calibro 22 perpendicolare al vaso sanguigno, perforare direttamente la vena e raccogliere il sangue in tubi di ematocrito mentre perla sulla superficie della pelle. La puntura deve essere il più vicino possibile al ginocchio per consentire un futuro campionamento anteriore a questo sito. Inoltre, assicurarsi che la profondità della puntura non sia più profonda della lunghezza della smussatura dell’ago. Per aiutare il flusso sanguigno, posizionare il ratto con la gamba più bassa del cuore. Infine, rilasciare la pressione sulla gamba e applicare pressione sul sito di puntura per ottenere l’emostasi e prevenire un’eccessiva perdita di sangue. Si noti che una quantità significativamente maggiore di sangue può essere raccolta utilizzando questa procedura.

Dopo aver discusso le basi delle tecniche di raccolta del sangue, esaminiamo alcuni esempi del perché queste procedure possono essere utili per la ricerca scientifica

Il sangue viene spesso analizzato per confermare la risposta immunitaria durante lo sviluppo del vaccino. Qui, i ricercatori hanno consegnato un vaccino peptidico agli animali affetti da cancro alla vescica. Successivamente, hanno raccolto il sangue attraverso la vena sottomandibolare e separato il siero per rilevare i livelli di diverse citochine, che fungono da indicatori dell’efficacia del vaccino.

La raccolta del sangue viene anche comunemente eseguita per testare l’efficacia di un trattamento studiando biomarcatori della malattia umana, come i livelli di glucosio nel diabete. Questi ricercatori erano interessati a testare l’efficacia di una nuova terapia genica erogata attraverso la vena della coda negli animali diabetici. Dopo l’iniezione, questi ricercatori hanno raccolto sangue dalla vena safena in diversi punti temporali per analizzare l’effetto di diversi protocolli di trattamento sul livello di glucosio nel sangue.

Infine, per alcuni esperimenti, è importante conoscere lo stato di base dell’animale, come i livelli di infiammazione o stress. In questo esempio, il plasma sanguigno è stato raccolto da un ratto prima e dopo un evento stressante. E come puoi vedere, il livello di corticosterone, o l’ormone dello stress, è più alto negli animali dieci minuti dopo l’evento stressante.

Hai appena visto la seconda puntata di JoVE sulle tecniche di prelievo di sangue per topi e ratti. Dopo aver guardato entrambi questi video, dovresti avere una migliore comprensione delle considerazioni e delle procedure per la raccolta del sangue da questi animali e di come vengono utilizzati nella ricerca biomedica oggi. Come sempre, grazie per aver guardato!

Applications and Summary

Il metodo di raccolta del sangue può causare una variazione nell’analisi del campione. Il livello di abilità del tecnico che esegue la raccolta dei campioni ha un impatto sulla qualità del campione e sul benessere dell’animale. L’uso di anestetici può anche influenzare la qualità del campione. I metodi qui descritti sono tutti eseguiti senza l’uso di anestesia, quindi quella variabile è stata eliminata. Inoltre, tutte queste tecniche possono essere utilizzate per il campionamento seriale con il minimo disagio per l’animale.

References

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Transcript

Collecting blood from mice and rats is necessary for a wide variety of scientific studies, and researchers have developed different methods to achieve specific experimental goals.

In the first installment, we discussed the general blood withdrawal consideration and reviewed the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection methods. Here, we will outline the procedures for blood collection from facial, submandibular, saphenous, and femoral veins. These methods are less invasive and do not require anesthesia, which makes them methods-of-choice when the use of anesthetics may confound blood results or other data.

Let’s begin with the procedure for obtaining a blood sample from a murine facial vein. On the mouse, there is an easily accessible facial vein that runs across the cheek. Start by choosing the proper equipment for the procedure. Basically, you need a small centrifuge tube for blood collection and a lancet, which is available in different sizes. Selection of correct lancet is dependent on the age, sex, and bodyweight of the animal and size of sample to be collected. See text protocol for details on lancet selection.

Begin the procedure by restraining the animal using the scruffing technique. Proper restraint minimizes side-to-side movement of the head and helps in ensuring accurate and safe venipuncture with the lancet. If the grip is too tight, the blood flow may be restricted resulting in a reduced volume collected. Once the animal is restrained, locate the approximate area of the facial vein by measuring the length of the eye below the lateral canthus and the width of the eye caudally. With the tip of the lancet gently feel for the point at which the jawbone ends. For better accuracy in puncturing the vessel, you may want to position the mouse on its side.

Now, at the insertion site, hold the lancet perpendicular to the skin surface with the tip facing slightly toward the nose. This is critical, because if the lancet tip is directed caudally, the ear canal will be pierced causing bleeding from the ear. To puncture the vein, apply a firm push and pierce the skin up to the lancet shoulder. Upon removal, the blood will begin to flow. To assist the flow, position the animal with the head lower than the heart. To stop bleeding, blot the puncture site to achieve hemostasis and prevent excessive blood loss. Lastly, release pressure on the scruff and return the animal to its cage. Note that the collection volumes will vary, but it is imperative NOT to exceed the maximum volume for survival blood collection. See the text protocol of the Blood Withdrawal One video for details on recommended maximum volume of collection.Serial samples can be taken by alternating the side used. Neither side should be used more often than every 5-7 days.

Now let’s review the submandibular vein bleed method. Although this is very similar to the technique for the facial vein bleed, there are variations in equipment and subtle differences in the bleeding procedure.

The submandibular vein runs along the lower jaw of the mouse and converges with the facial vein into the jugular vein. Instead of a lancet, this method is performed using needles. But similar to lancets, selection of needle gauge is dependent on the age, sex, and animal’s weight and sample size – see text protocol for details.

To start, scruff the animal in the same manner as for the facial vein bleed so that there is minimal side-to-side movement of the head. Recall – overly tight grip may decrease blood collection volume. While restraining the mouse, imagine a line from the corner of the mouth across the face and a line from the lateral canthus of the eye. The intersection point of these lines is the approximate area of the submandibular vein. This coincides with a small hairless dimple found caudal to the corner of the mouth and slightly below the jaw line.

For better accuracy, place the animal in lateral recumbency (3.6.1). Next, hold the needle perpendicular to the surface of the skin and insert it with a firm push. DO NOT insert the needle beyond the bevel tip, as insertion depth greater than that may result in trauma to the muscles, nerves and other vessels that are in the head, neck, and oral cavity. Upon removal of the needle, the blood will begin to flow. Like for facial vein bleed, position the mouse with the head lower than the heart to assist with the blood flow. Finally, blot the puncture site to achieve hemostasis and release pressure on the scruff to return animal to its cage.

Now, let’s learn how to collect blood from the saphenous vein. This vein is a superficial vessel that runs dorsally and then laterally across the tarsal joint.

The equipment that you need for this procedure includes a restraining device, which could be a flexible plastic one for rats or, for mice a modified 50-milliliter plastic conical tube can be used. Note that the tube end is cut off to allow a breathing hole, and a half-inch wide and 2-inches long slot is cut from the cap end. The edges are covered in clot tape for animal’s safety. This procedure also requires a tourniquet — manufactured using a 3 cc syringe and a length of 0-2 non-absorbable suture, triple antibiotic ointment with a swab — to be used as a moisture proof barrier between the skin and the blood droplet, a hair clipper, a 22 gauge needle for venipuncture, and hematocrit tube for blood collection.

To restrain a mouse, place it into the tube, nose first. Then, gently guide the hind leg into the slot and stabilize it using the index finger and thumb. Subsequently, shave the hair from the lateral aspect of the leg from the hock to the stifle. Next, smear a very thin layer of the triple antibiotic ointment to the hairless area. Following that, apply the tourniquet as far cranially as possible and tighten it. The saphenous vessel running across the outer surface from the knee to the ankle will begin to fill and will become raised and easy to visualize.

Next, hold a 22-gauge needle directly over the blood vessel and perpendicular to the surface of the skin. And puncture the vessel, being careful not to insert the needle too deeply and puncturing muscle or bone. The blood will bead up on the surface of the leg for collection into a hematocrit tube. Once the blood has been collected, loosen the tourniquet and apply pressure over the puncture for hemostasis. After the bleeding has stopped, remove the animal from the restraint and return it to its cage. Volumes collected with this method are between 10 to 150 μL, depending upon the frequency of sampling. And the sample quality is variable, as it may contain tissue products. No more than 4 blood samples should be taken within a 24-hour period from the same leg.

Lastly, we will learn how to collect blood from the femoral vein, which is another option for blood collection on a rat. The femoral vein runs on the medial aspect of the hind leg from the groin to the knee joint before crossing the knee and becoming the lateral saphenous vein, making it easily accessible.

The advantage to femoral vein bleed is that a larger volume is more easily collected than from the saphenous vein. The disadvantage is that this procedure, in a conscious animal, requires two people. The equipment needed for this procedure are similar to the saphenous vein method, except that it does not require the tourniquet, and the preferable restraining device is a flexible cone. To select the correct cone, measure it against the animal’s body length and then make an oval hole cut at the level of the thigh.

To restrain the animal, place it into the tube, nose first. Then, fold the end of the cone and close it using a small binder clip to prevent the animal from exiting. Now pull the hind leg through the oval opening to gain access to the femoral vein. Don’t grip too tightly as it might exacerbate hematoma formation. Next, shave off the inner surface of the leg from the groin to the knee, and apply thin layer of triple antibiotic ointment to the hairless area. Subsequently, the restraint person should occlude the femoral vein and grasp the rat with inner surface of the leg facing the person who is going to draw blood. Holding the 22-gauge needle perpendicular to the blood vessel, directly puncture the vein and collect the blood in hematocrit tubes as it beads on the skin surface. The puncture should be as close to the knee as possible to allow for future sampling anterior to this site. Also, ensure that the depth of the puncture is no deeper than the length of the bevel of the needle. To assist the blood flow, position the rat with the leg lower than the heart. Finally, release pressure on the leg and apply pressure on the puncture site to achieve hemostasis and prevent excessive blood loss. Note that significantly more amount of blood can be collected using this procedure.

After discussing the basics of blood collection techniques, let’s review some examples of why these procedures may be useful for scientific research

Blood is often analyzed to confirm the immune response during vaccine development. Here, researchers delivered a peptide vaccine to animals suffering from bladder cancer. Next, they collected blood via the submandibular vein and separated the serum to detect the levels of different cytokines, which serve as indicators of vaccine effectiveness.

Blood collection is also commonly performed to test efficacy of a treatment by studying biomarkers of the human disease, like glucose levels in diabetes. These researchers were interested in testing the efficacy of a novel gene therapy delivered via the tail vein in diabetic animals. Following injection, these investigators collected blood from the saphenous vein at several time points to analyze the effect of different treatment protocols on blood glucose level.

Lastly, for some experiments, it is important to know the basic status of the animal, such as levels of inflammation or stress. In this example, blood plasma was collected from a rat before and after a stressful event. And as you can see, the corticosterone, or the stress hormone, level is higher in animals ten minutes following the stressful event.

You’ve just watched JoVE’s second installment on blood withdrawal techniques for mice and rats. After watching both these videos, you should have a better understanding of the considerations and procedures for blood collection from these animals and how they are being used in biomedical research today. As always, thanks for watching!