Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila

Per iniziare questo test Neurocircuito, le mosche sono montate su cera dentale. Su un vetrino vengono inseriti quattro elettrodi nella mosca. Un elettrodo di terra nell'addome, un elettrodo di registrazione nel volo longitudinale dorsale, i muscoli nel torace e due elettrodi stimolanti nella testa.

Il posizionamento dell'elettrodo è confermato trovando la soglia della fibra gigante e notando una risposta visibile. Alla mosca viene consegnato un treno d'onda ad alta frequenza della tensione desiderata e, se non si verifica alcun grippaggio, la traccia sull'oscilloscopio sarà piatta. Se si verifica una crisi, la traccia mostrerà un'attività incontrollata come risposta allo stimolo ad alta frequenza.

Ciao, sono Mark Toay, professore presso il Dipartimento di Politica e Gestione delle Scienze Ambientali dell'Università della California a Berkeley. Oggi vi mostreremo una procedura per il dosaggio delle crisi elettrofisiologiche in drosofila. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le convulsioni nei mutanti di drosophila e determinare le soglie convulsive per questi mutanti.

Quindi iniziamo. La notte prima dell'esperimento, i moscerini maschi del genotipo richiesto vengono anestetizzati con anidride carbonica e posti in una fiala di cibo fresco chiusa con un tappo di nylon morbido o un batuffolo di cotone. Dopo l'anestesia con anidride carbonica, la soglia di convulsione viene alterata, quindi è meglio lasciare le mosche per almeno sei ore, anche se la notte è l'ideale.

Il giorno dell'esperimento, le mosche vengono montate una alla volta su vetrini con uno strato di cera dentale su un lato. Le mosche vengono manipolate senza anestesia venendo prelevate dalla testa, utilizzando un ago smussato calibro 23 collegato a una linea del vuoto. Vengono quindi montati sui vetrini spingendo verso il basso le gambe e le ali nella cera dentale.

Una volta che la mosca è immobilizzata, la cera viene spinta verso l'alto intorno al collo e agli occhi per immobilizzare completamente la testa. La mosca è ora montata e pronta per l'elettrofisiologia. La configurazione elettrofisiologica è composta da tre set di micro manipolatori, ciascuno con uno o due elettrodi di tungsteno affilati collegati.

Gli elettrodi di tungsteno vengono utilizzati nudi e non richiedono soluzione fisiologica. La tensione è fornita da uno stimolatore collegato a un'unità di isolamento collegata agli elettrodi stimolanti. L'elettrodo di registrazione è collegato a un preamplificatore, che a sua volta è collegato a un oscilloscopio a memoria digitale.

Anche se non è essenziale, è utile avere un altoparlante collegato all'oscilloscopio in modo che le risposte possano essere udibili. La mosca immobilizzata viene ora posizionata sul tavolino del microscopio e un elettrodo di terra viene inserito nell'addome della mosca. L'elettrodo di registrazione viene inserito in uno dei muscoli longitudinali dorsali del torace della mosca.

Gli elettrodi affilati sono abbastanza forti da perforare l'esoscheletro. Se si presta attenzione, occasionalmente gli elettrodi si piegano e devono essere sostituiti. Gli elettrodi stimolanti vengono inseriti attraverso la cuticola della testa nello spazio tra l'occhio e l'antenna.

La mosca è ora predisposta per effettuare registrazioni. Quindi, preparare gli strumenti per la registrazione. Lo stimolatore deve avere le seguenti impostazioni per impostare un intervallo di impulsi continui di due secondi tra ogni impulso, un ritardo dell'impulso pari a zero e un'ampiezza dell'impulso non superiore a 0,2 millisecondi.

L'oscilloscopio deve avere la funzione di archiviazione attivata e avere le seguenti impostazioni. Il tempo per divisione deve essere impostato su un millisecondo per divisione. I vault per divisione devono essere impostati su 100 millivolt per divisione in un secondo momento.

Se la risposta non è idealmente forte, questa impostazione può essere modificata a 50 millivolt per divisione. La soglia della fibra gigante è determinata erogando singoli impulsi elettrici di tensione incrementale e annotando la tensione minima richiesta per registrare la nostra risposta nell'elettrodo di registrazione. Questa misura è in genere di circa due volt.

Una volta determinata la soglia della fibra gigante, smettere di pulsare la mosca e modificare le impostazioni sul cannocchiale di Oslo a 0,2 secondi per divisione. Ora modifica le impostazioni sullo stimolatore. Impostare l'intervallo di impulsi su un singolo impulso e attivare il treno di impulsi.

I parametri della forma d'onda sono impostati su impulsi di 0,5 millisecondi a 200 hertz Per 300 millisecondi, la tensione viene modificata all'impostazione desiderata e un treno d'onde ad alta frequenza di impulsi viene erogato al cervello della mosca per indurre un attacco. Dopo il treno di impulsi, la traccia dell'oscilloscopio mostrerà una componente piatta. Se in questo caso non viene indotta una crisi, se le impostazioni vengono rapidamente riportate a quelle di quando è iniziata la registrazione, i singoli impulsi causeranno una risposta nel sistema a fibra gigante.

Se viene indotta una crisi epilettica, l'oscilloscopio mostrerà l'attività simile a una crisi dopo il treno. Ora, se le impostazioni vengono rapidamente riportate alle impostazioni originali, i singoli impulsi non riusciranno ad attivare una risposta. Nel sistema a fibra gigante.

I moscerini hanno un periodo refrattario dopo un treno d'onda di stimolo ad alta frequenza durante il quale non può essere indotta un'attività simile a una crisi. Se non si verifica alcuna crisi, le mosche sono refrattarie per circa sette minuti. E se viene indotta una crisi epilettica, le mosche sono refrattarie per circa 17 minuti dopo il periodo refrattario.

Ulteriori stimoli ad alta frequenza possono essere erogati alla stessa mosca a tensioni, superiori o inferiori a quelle del treno precedente, fino a quando non viene determinata la soglia di convulsione o fino a quando la risposta della fibra gigante diventa troppo debole per essere vista, nel qual caso la mosca deve essere scartata e deve essere avviato un nuovo esperimento. Al termine dell'esperimento, la mosca viene rimossa dalla configurazione elettrofisiologica, rilasciata dalla cera e smaltita le mosche montate in modo errato con il corretto posizionamento degli elettrodi. La stimolazione ad alta frequenza a una tensione scelta può portare a un'attività simile a una crisi epilettica in cui non si verifica alcuna crisi.

La traccia subito dopo la stimolazione è piatta. Quando si verifica un sequestro, la traccia mostrerà un'attività incontrollata. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire il test per convulsioni e drosofila utilizzando l'elettrofisiologia.

Quando si utilizza questo test, è importante che la mosca sia montata correttamente in modo che gli elettrodi possano essere inseriti facilmente. Posizionato in modo improprio. Gli elettrodi sono la causa più difficile di problemi per questo test.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.