In vivo Bioluminescent Imaging dei tumori mammari che usano lo spettro IVIS

Per iniziare questa procedura, la linea cellulare tumorale mammaria che esprime luciferasi viene scongelata da steli congelati e quindi espansa in coltura fino a raggiungere una fluenza COF del 90%. La diluizione seriale delle cellule sospese viene quindi seminata in 96. Le piastre del pozzetto esposte a Luciferiano e quindi il numero ottimale di cellule che generano emissioni fluorescenti superiori a 500 fotoni viene determinato utilizzando una piastra Le cellule del lettore vengono quindi iniettate, per via sottocutanea, nel fianco di un animale e quindi viene iniettata la luciferasi.

Le cellule intraperitoneali possono essere visualizzate già 10 minuti dopo la somministrazione di Lucifer e la massa tumorale può essere visualizzata fino a un mese in vivo fino all'inizio della necrosi. Ciao, sono Ed Lim del Laboratorio di Imaging presso Caliper Life Sciences ad Alameda, in California. Oggi vi mostreremo una procedura per monitorare la crescita tumorale nei topi in modo non invasivo utilizzando la bioluminescenza.

Questa procedura viene utilizzata nel nostro laboratorio e nel laboratorio IVUS, in tutto il mondo, per studiare la crescita e lo sviluppo del tumore, soprattutto dopo il trattamento con composti farmacologici. Quindi iniziamo. Questa procedura inizia preparando la linea cellulare tumorale per l'iniezione nel topo.

Un'ampia gamma di linee cellulari tumorali che esprimono luciferasi può essere utilizzata per esperimenti preclinici bioluminescenti. Queste cellule sono fornite come coltura congelata priva di agenti patogeni, che crescerà facilmente in terreni standard senza bisogno di marcatori di selezione. Per il nostro esperimento, utilizzeremo la linea cellulare di tumore mammario murino 41 Luke two, che esprime il gene della luciferasi che funge da indicatore ottico dell'espressione genica o della tumorgenesi.

In vivo, utilizzeremo l'espressione della luciferasi per monitorare la crescita del tumore primario in modo non invasivo, ma può anche essere utilizzata per localizzare e monitorare le lesioni metastatiche. L'attività della luciferasi deve essere verificata prima dell'iniezione e, per fare ciò, un pallone confluente al 90% viene raccolto dalla tripsina e quindi contato. 50.000 cellule vengono quindi dispensate in un singolo pozzetto di una piastra per microtitolazione e viene eseguita la diluizione in serie.

Lucifer viene aggiunto ai pozzetti a 150 microgrammi per millilitro e incubato per due minuti. La micropiastra può essere visualizzata in ivus o in un lettore di piastre luminescenti per determinare i livelli di espressione. Questa linea cellulare esprime fino a 6.500 fotoni al secondo per cellula, ma qualsiasi livello di espressione superiore a 30 fotoni al secondo per cellula può essere ripreso con successo in vivo.

Ora che abbiamo cellule di attività ottimale, possiamo procedere alla fase di iniezione sottocutanea. Al fine di facilitare la rilevazione ottimale del tumore, stiamo utilizzando un ceppo di topo nudo immunocompromesso al timo A. Prima dell'iniezione, gli animali vengono anestetizzati utilizzando fluoro ISO al 3% per cinque minuti per l'anestesia profonda.

Successivamente, inietteremo 250.000 cellule in un centinaio di microlitri di PBS per via sottocutanea nel fianco. Caricare le cellule in una siringa da un millilitro e inserire un ago calibro 26. Sollevare delicatamente la pelle con una pinza per formare una tenda e iniettare le cellule alla base.

Le cellule appena iniettate possono essere visualizzate immediatamente. Un totale di 150 milligrammi di Lucifero per chilogrammo di peso corporeo viene quindi somministrato tramite due iniezioni nella cavità peritoneale. In questo studio, gli animali vengono sottoposti a imaging 10 minuti dopo l'iniezione di luciferino per garantire un flusso di fotoni costante.

Te lo mostreremo nel prossimo passaggio. Per il nostro esperimento, utilizzeremo il sistema di imaging in vivo a spettro IVUS, che utilizza un dispositivo accoppiato a carica diluita sul retro raffreddato a 90 gradi Celsius negativi per ottenere la massima sensibilità. Per supportare la quantificazione assoluta, il sistema misura la carica oscura durante i tempi di inattività ed esegue un'autocalibrazione durante l'inizializzazione.

Per avviare l'imaging, inizializzare il sistema IVUS e impostare i parametri di imaging per l'esperimento. Selezionare il campo visivo. Per il numero di animali da riprendere, è possibile mantenere fino a cinque animali nello strumento utilizzando il collettore anestetico integrale.

Lo stadio è a una temperatura costante di 37 gradi Celsius per mantenere la temperatura corporea negli animali. Viene fornita una porta ECG per monitorare la salute degli animali durante le procedure stressanti in vita L'esposizione al software di immagini, il tempo F-stop e il legame pix possono essere ottimizzati in base al livello di espressione della linea cellulare. Queste impostazioni possono essere modificate in qualsiasi momento durante un esperimento senza influire sul risultato quantitativo.

L'Ivus acquisisce un'immagine fotografica dell'animale sotto luce bianca in un segnale quantitativo bioluminescente o fluorescente, che viene sovrapposto all'immagine, il segnale bioluminescente viene espresso in fotoni al secondo e visualizzato come una mappa di intensità. La visualizzazione dell'immagine viene regolata per fornire un contrasto e una risoluzione ottimali nell'immagine senza influire sulla quantificazione. La luminescenza delle cellule può essere misurata nel sito di iniezione utilizzando una regione di interesse. Strumento.

I dati di misura sono visualizzati nella tabella insieme a tutti i parametri sperimentali relativi all'acquisizione dell'immagine, che possono essere salvati o esportati. Per l'analisi, è possibile acquisire e confrontare più immagini e studi longitudinali che coprono secondi o mesi a seconda della natura dell'esperimento. Misureremo il flusso di fotoni dal tumore al tempo zero e monitoreremo per quattro settimane.

Con l'imaging a intervalli bisettimanali, il flusso di fotoni dal tumore è proporzionale al numero di cellule vive che esprimono luciferasi. Quindi la bioluminescenza è direttamente correlata alle dimensioni del tumore a cinque giorni dall'impianto. Il tumore non è ancora palpabile, ma le cellule possono essere quantificate attraverso la bioluminescenza e si vede che il tumore sta crescendo attivamente.

In questa fase, il segnale di bioluminescenza è molto più forte. Il tempo di esposizione f-stop e la rotazione dei pixel possono essere regolati in modo che l'immagine sia chiara e la fotocamera non si saturi. L'IVUS compensa automaticamente le variazioni nella raccolta della luce.

Quindi queste misurazioni potrebbero essere confrontate con quelle raccolte in precedenza e in seguito. Nell'esperimento. A 15 giorni dall'impianto, i tumori sono palpabili e la misurazione della bioluminescenza ha già generato 15 giorni di dati.

A 28 giorni, i tumori post-impianto diventano necrotici e le cellule iniziano a morire. La dimensione del tumore stimata dalla misurazione del calibro non cambia in modo apprezzabile, ma la luminescenza del tumore diminuirà. L'indicazione del calibro di morte cellulare e la misurazione della bioluminescenza possono essere continuate fino al raggiungimento di un endpoint umano.

La necrosi tumorale dovuta all'ipossia o ai regimi di trattamento sarà indicata da una ridotta bioluminescenza anche se non riducono la massa tumorale. Vi abbiamo appena mostrato come monitorare lo sviluppo del tumore sottocutaneo, un semplice modello murino di xenotrapianto utilizzando l'imaging bioluminescente. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di controllare il livello di espressione delle cellule prima dell'impianto.

In secondo luogo, per la massima riproducibilità dell'immagine degli animali al momento ottimale dopo l'iniezione luciferina. La sensibilità del metodo consente di monitorare lo sviluppo del tumore nelle fasi iniziali perché i tumori possono essere misurati dalla bioluminescenza molto prima di poter essere misurati in modo affidabile dai calibri. Ricordati di ottimizzare i parametri di imaging in ogni fase Quel segnale di luminescenza non si satura, ma con la luminescenza, gli animali possono essere monitorati quantitativamente per mesi per studiare gli effetti di remissione e recidiva.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.