Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

Il protocollo di silenziamento genico indotto dal virus inizia con la crescita dei ceppi afasici. PT RV uno, PT RV due pt, RV due PT S e PT RV due gene bersaglio su piastre LB. Due giorni dopo, questi ceppi vengono inoculati in LB liquido e coltivati durante la notte.

Questa coltura viene quindi utilizzata per inoculare una coltura liquida mediale a induzione secondaria, che viene anch'essa coltivata durante la notte. Il giorno successivo, viene preparata una sospensione batterica di ciascuna coltura e sia il gene bersaglio PT RV 1 che PT RV 2 o PT RV 2 due vengono miscelati in un rapporto uno a uno. La miscela batterica viene quindi infiltrata nelle piantine di anas o di pomodoro utilizzando una siringa senza ago.

Ciao, sono Andre Velazquez del laboratorio di Greg Martin presso il Dipartimento di Patologia Vegetale e Microbiologia Vegetale della Cornell University. Oggi ti mostreremo come eseguire il silenziamento genico indotto da virus pomodoro e nicotiana. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le interazioni tra un patogeno delle piante e il suo ospite.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura per i ceppi da agrobacterium a fassan, ciascuno dei quali ospita PT RV uno, PT RV due pt, RV due PDS o PT RV due plasmidi del gene bersaglio ospite vengono coltivati su griglie LB integrate con kanamicina e rifampicina. La kanamicina seleziona per il plasmide PTRV mentre la rifampicina seleziona per l'agrobatterio.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni quando le colonie batteriche sono cresciute sulle piastre LB, utilizzare ciascuno dei ceppi per inoculare quattro, due o tre millilitri di colture di LB liquido contenente kanamicina e rifampicina. Incubare le colture a 30 gradi Celsius agitando a 200 giri/min per 16-18 ore. Il giorno seguente, inoculare una diluizione da uno a 25 di ciascuna coltura primaria in cinque millilitri di una coltura secondaria di terreno di induzione liquida con micina rifampicina can e 200 micromolari di acetofenone.

L'IM imita l'ambiente che l'Agrobacterium incontra nell'alast ospite e l'acetofenone induce i geni VI batterici necessari per il trasferimento del TD NA nella pianta. Incubare le colture a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min per 20-24 ore. Il giorno successivo raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 10 minuti a 3000 g.

Dopo aver rimosso il surnatante S, aggiungere cinque millilitri di cloruro di magnesio 10 millimolare, 10 millimolari di MES pH 5,5 al pellet e sospendere nuovamente le cellule mediante vortice delicato, centrifugare nuovamente le cellule per 10 minuti a 3000 Gs, quindi risospendere le cellule in metà del volume della coltura originale con la soluzione MES di cloruro di magnesio. Preparare una sospensione batterica con un OD 600 di 0,3 per ogni coltura batterica. Aggiungere acetone a una concentrazione finale di 400 micromolari alla coltura PT RV one.

Mescolare le colture contenenti il gene bersaglio ospite PT RV uno e PT RV due o il gene bersaglio ospite PT RV due in un rapporto uno-uno, includere anche un controllo PT RV due PDS. La concentrazione finale di acetone è ora di 200 micromolari e ogni coltura è a un OD 600 di 0,15. Le colture sono ora pronte per essere utilizzate per l'infiltrazione virale delle piante di nicotiana, hamana e pomodoro e le piante di hamana utilizzate per il silenziamento dovrebbero avere circa due settimane e mezzo quando sono emersi i coen e le prime due o quattro foglie vere.

Le piante di pomodoro vengono utilizzate da sette a otto giorni dopo l'emergenza, quando le foglie vere non sono ancora apparse. Etichettate le piantine da infiltrare con il gene da silenziare e la data dell'esperimento per l'infiltrato di pomodoro sia oleano che per Ana. Infiltrati nelle due foglie vere più grandi.

Fai un buco in ogni foglia per infiltrarla con un ago. Utilizzare una siringa senza ago da un millilitro per infiltrare la sospensione batterica nelle piantine per evitare la contaminazione incrociata. Cambiate i guanti tra un'infiltrazione e l'altra e non innaffiate le piante fino al giorno successivo all'inoculazione.

Dopo l'infiltrazione, mantieni le piante a una temperatura compresa tra 20 e 22 gradi Celsius in una camera di crescita con una durata del giorno di 16 ore e un'umidità relativa del 50% per almeno tre settimane e mezzo prima di utilizzarle per i saggi. Questo è un risultato rappresentativo di un esperimento con ana e piante di pomodoro tre settimane e mezzo dopo essere state silenziate per il gene fitodesaturato. Entrambe le piante mostrano il caratteristico fenotipo di sbiancamento osservato nelle piante con quantità ridotte di carotenoidi.

Per gli impianti di controllo silenziati PDS, infatti, il fotosbiancamento inizia a manifestarsi già una settimana e mezza dopo l'infiltrazione. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire il silenziamento che induce il virus in ana e pomodoro. In questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a evitare la contaminazione incrociata e di mantenere le piante nelle condizioni ambientali adeguate che favoriscono la diffusione del virus e il silenziamento.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.