Name: Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Impara il silenziamento genico virale (VIGS) per studiare la funzione genica in Nicotiana benthamiana e pomodoro. Questo metodo consente il knock-down transitorio dell'espressione genica mediante infiltrazione batterica.

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Ringraziamo il Dott. Patricia Manosalva per le sue preziose informazioni sul manoscritto. Il finanziamento è stato fornito dal Programma Nazionale Genoma Plant Science Foundation, il numero di riconoscimento DBI-0605059.

Parte 1: Materiale vegetale N. benthamiana piante utilizzate per tacere dovrebbe essere intorno al 2 ½ settimane di vita che è il momento in cui i cotiledoni e le prime 2 - 4 foglie vere sono emerse. Pomodoro (Solanum lycopersicum) piante vengono utilizzate 7-8 giorni dopo l&#39;emergenza, quando le foglie vere non sono ancora apparsi. Parte 2: VIGS GIORNO 1 <ol><li> Per ogni esperimento, Agrobacterium tumefaciens ospitare pTRV1, pTRV2, pTRV2-Pds e pTRV2-host gene bersaglio vengono coltivati ​​su piastre di agar LB integrata con 50 mg / ml di kanamicina e 100 mg / ml di rifampicina. La kanamicina seleziona per la pTRV plasmide mentre la rifampicina lo fa per l&#39;Agrobacterium. Incubare la piastra a 30 ° C per 2 giorni. Silenziamento del PDS causerà le piante a photobleach ed è utilizzato come controllo di efficienza a tacere. Inoltre, i geni per essere inibiti deve essere clonato in un vettore pTRV2. C&#39;è un gateway compatibile pTRV2 vettore che possono facilitare la clonazione ed è descritto da Liu et al. (2002). </li></ol> 3 ° GIORNO <ol><li> Inoculare 2-3 ml di coltura liquida LB con gli antibiotici di cui sopra per ciascuno dei ceppi. Incubare agitando a 30 ° C per 16 - 18 ore e 200 giri al minuto </li></ol> GIORNO 4 <ol><li> Inoculare 1: 25 diluizione della coltura principale in una media secondaria di induzione liquido (IM) cultura IM con kanamicina, rifampicina e 200 acetosyringone mM (Tabelle 1, 2 e 3). Il acetosyringone viene utilizzato come un induttore dei geni vir di Agrobacterium che sono necessarie per T-DNA trasferimento nella pianta 9, mentre l&#39;IM imita l&#39;ambiente questo patogeno incontra nel apoplast ospitante. Incubare agitando a 30 ° C per 20 - 24 ore e 200 giri al minuto </li></ol> GIORNO 5 <ol><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 minuti a 3000 x g. Risospendere nello stesso volume che la cultura originale era con 10 mM MgCl 2, 10 mM MES pH 5,5. Cellule possono essere delicatamente in agitazione per sospendere di nuovo loro. </li><li> Centrifugue le cellule di nuovo per 10 minuti a 3000 x g. Risospendere in metà del volume della cultura di origine con 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,5. </li><li> Preparare una sospensione batterica con un diametro esterno 600 di 0,3 per ogni coltura batterica. Aggiungi acetosyringone ad una concentrazione finale di 400 mM alla cultura pTRV1. </li><li> Mescolare le culture che contiene il pTRV1 e pTRV2 (o il pTRV2 contenente il gene di interesse) in un rapporto 1 a 1. Includono anche una pTRV2-PDS controllo. Si prega di notare che la concentrazione acetosyringone finale è ora 200 micron e che ogni cultura è a 600 OD di 0,15. </li><li> Etichetta le piantine di essere infiltrati con il gene per essere messa a tacere e la data dell&#39;esperimento. </li><li> Fare un buco in ogni foglia di essere infiltrati con un ago. Utilizzare una siringa da 1 ml manco a infiltrarsi nella sospensione batterica nelle piantine. Per il pomodoro, si infiltrano entrambi i cotiledoni mentre per N. benthamiana, infiltrare il più grande due foglie vere. Cinque mL di ciascuna miscela batterica dovrebbe essere sufficiente per infiltrarsi 15 N. benthamiana e 25 piantine di pomodoro. Evitare la contaminazione incrociata, cambiando i guanti tra infiltrazioni e non innaffiare le piante fino al giorno successivo, dopo l&#39;inoculazione. </li><li> Gli impianti sono tenuti a 20-22 ° C in una camera di crescita con una lunghezza del giorno 16 ore e 50% UR per almeno 3 settimane e mezzo prima di poter essere utilizzato per le analisi. </li></ol> Parte 3: I risultati rappresentativi La Figura 1 mostra un esperimento rappresentativo con N. benthamiana e piante di pomodoro a tacere per PDS. Le piante mostrano il fenotipo caratteristico photobleaching osservato in impianti con diminuita quantità di carotenoidi. Per il PDS-tacere le piante di controllo, inizia photobleaching di essere visto non appena 1 ½ settimane dopo l&#39;infiltrazione. <img src="/files/ftp_upload/1292/Figure 1A 1292.jpg" alt="figura 1a" /><img src="/files/ftp_upload/1292/Figure 1B 1292.jpg" alt="figura 1b" /> Figura 1. Silenziamento del gene di controllo PDS cause photobleaching in N. benthamiana (A) e pomodoro (B) le piante. Fotografie sono state scattate 3 settimane e mezzo dopo tacere. Tabella 1. Preparazione del mezzo di induzione (IM). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 400 mL </td><td> H 2 O distillata </td></tr><tr><td> 4,88 g. </td><td> MES (2 - (4 morfolino)-etano solfonico) </td></tr><tr><td> 2,5 g </td><td> Glucosio </td></tr><tr><td> 0,12 g </td><td> NaH 2 PO 4 </td></tr></tbody></table> Portare ad un volume finale di 475 ml con dH 2 O e portare il pH a 5,6. Autoclave. Dopo che il medium è raffreddato, aggiungere 25 ml di 20X sali AB. Tabella 2. Preparazione di sali AB. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 20 g </td><td> NH 4 Cl </td></tr><tr><td> 6 g </td><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td></tr><tr><td> 3 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,2 g </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05 g </td><td> FeSO 4 · 7H 2 O </td></tr></tbody></table> Portare ad un volume finale di 1 litro con acqua distillata. Autoclave. Essere consapevoli del fatto che i sali di AB precipitare come una polvere arancione. Basta mescolare bene agitando prima del loro utilizzo. Tabella 3. Preparazione di 200 Acetosyringone mM. Si prega di notare che acetosyringone deve essere preparato il giorno in cui verrà utilizzato. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 19,6 mg </td><td> Acetosyringone (3 &#39;, 5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone) </td></tr><tr><td> 500 microlitri </td><td> DMSO (dimetil solfossido) </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+as+a+plant+immune+system+against+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA silencing as a plant immune system against viruses.</a> Trends Genet. 17, 449-459 (2001).</li>
<li>Carrington, J. C., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microRNAs+in+plant+and+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of microRNAs in plant and animal development.</a> Science. 301, 336-338 (2003).</li>
<li>Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+as+a+translational+repressor+of+APETALA2+in+Arabidopsis+flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development.</a> Science. 303, 2022-2025 (2004).</li>
<li>Palatnik, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leaf+morphogenesis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of leaf morphogenesis by microRNAs.</a> Nature. 425, 257-263 (2003).</li>
<li>Brigneti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+pathogenicity+determinants+are+suppressors+of+transgene+silencing+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana.</a> EMBO J. 17, 6739-6746 (1998).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant Journal. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>MacFarlane, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+tobraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the tobraviruses.</a> J. Gen. Virol. 80, 2799-2807 (1999).</li>
<li>Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+to+determine+the+extent+of+gene+silencing+in+Nicotiana+benthamiana+and+other+Solanaceae+species+when+heterologous+gene+sequences+are+used+for+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">A systematic study to determine the extent of gene silencing in Nicotiana benthamiana and other Solanaceae species when heterologous gene sequences are used for virus-induced gene silencing.</a> New Phytol. 176, 782-791 (2007).</li>
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<li>Miki, D., Itoh, R., Shimamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+of+single+and+multiple+members+in+a+gene+family+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice.</a> Plant Physiol. 138, 1903-1913 (2005).</li>
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<li>Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Kumar-Dinesh, S. P., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+MAPK+cascades%2C+NPR1%2C+and+TGA+transcription+factors+play+a+role+in+Pto-mediated+disease+resistance+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato.</a> Plant J. 36, 905-917 (2003).</li>
<li>Liu, E., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cDNA+libraries+for+virus-induced+gene+silencing+%28VIGS%29+using+tobacco+rattle+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus.</a> Plant. Methods. 4, 5-5 (2008).</li>
</ol>

Virale silenziamento genico è un metodo che permette un rapido schermi della genetica inversa. Evita la generazione di T-DNA o geni mediata trasposone knock-out, che sono disponibili solo in alcune piante come Arabidopsis e mais. Si aggira anche il processo che richiede tempo di trasformazione di piante e permette il targeting dei geni multipli allo stesso tempo, a condizione che abbiano homology sufficienti 10 o che diverse sequenze di host di destinazione sono disposti in tandem nel silenzio Vettor...

virale silenziamento genico (vigs) in nicotiana benthamiana e pomodoro

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Interferenza dell&#39;RNA (RNAi) è altamente specifico silenziamento genico fenomeno innescato da dsRNA 1. Questo meccanismo di silenziamento utilizza due grandi classi di RNA regolatori: microRNA, che sono prodotte da geni che codificano proteine ​​e non breve RNA interferenti (siRNA). Le piante usano RNAi per controllare trasposoni e di esercitare uno stretto controllo sui processi di sviluppo come la formazione di organi di fiori e foglie sviluppo 2,3,4. Piante anche usare RNAi per difendersi contro le infezioni da virus. Di conseguenza, molti virus si sono evoluti soppressori di silenziamento genico per consentire loro colonizzazione successo del loro ospite 5. Virale silenziamento genico (VIGS) è un metodo che sfrutta la RNAi mediato da meccanismi di difesa piante antivirali. In piante infette da virus modificato il meccanismo è specificamente mirate contro il genoma virale. Tuttavia, con vettori di virus che trasportano sequenze derivate da geni dell&#39;organismo ospite, il processo può essere ulteriormente mirate contro il mRNA host corrispondente. VIGS è stato adattato per la genomica funzionale high-throughput nelle piante utilizzando il patogeno per le piante Agrobacterium tumefaciens per fornire, tramite il suo Ti plasmide, un virus ricombinante portando l&#39;intero o parte della sequenza genica mirata per tacere. Diffusione del virus sistemico e il endogeno impianti RNAi macchinari prendersi cura del resto. dsRNAs corrispondente al gene bersaglio vengono prodotti e poi scisso dal Dicer ribonucleasi in siRNA del 21-24 nucleotidi di lunghezza. Queste siRNA in ultima analisi, guida l&#39;RNA di silenziamento indotto complesso (RISC) a degradare la trascrizione obiettivo 2. Diversi vettori sono stati impiegati in VIGS e uno dei più frequentemente utilizzato è basato su tabacco sonaglio virus (TRV). TRV è un virus bipartito e, come tale, A. due diversi ceppi di Agrobacterium sono usati per VIGS. Si porta pTRV1, che codifica le funzioni di replicazione virale e il movimento, mentre l&#39;altro, pTRV2, porti la proteina di rivestimento e la sequenza usata per VIGS 6,7. Inoculazione di Nicotiana benthamiana e di piantine di pomodoro con un misto di entrambi i risultati ceppi di silenziamento genico. Silenziamento del endogeno phytoene desaturasi (PDS) del gene, che provoca photobleaching, viene utilizzato come controllo per l&#39;efficienza VIGS. Va notato, tuttavia, che il silenziamento di pomodoro è generalmente meno efficiente rispetto a N. benthamiana. Abbondanza trascrizione dell&#39;RNA del gene di interesse deve essere sempre misurata per garantire che il gene bersaglio è stato efficacemente down-regolato. Tuttavia, sequenze di geni eterologhi da N. benthamiana può essere utilizzato per mettere a tacere i rispettivi ortologhi di pomodoro e viceversa 8.

Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; E pomodoro.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un fenomeno di silenziamento genico altamente specifico innescato da dsRNA1. Questo meccanismo di silenziamento utilizza due classi principali di RNA...

Il protocollo di silenziamento genico indotto da virus inizia con la coltivazione dei ceppi di aphasian. PT RV uno, PT RV due pt, RV due PT S e PT RV due gene bersaglio su piastre LB. Due giorni dopo, questi ceppi vengono inoculati in LB liquido e coltivati per tutta la notte.Questa coltura viene quindi utilizzata per inoculare una coltura liquida secondaria in mezzo di induzione, che viene anch'essa coltivata per tutta la notte. Il giorno successivo, viene preparata una sospensione batterica di ciascuna coltura e sia PT RV uno che PT RV due o il gene bersaglio PT RV due vengono mescolati in rapporto uno a uno. La miscela batterica viene quindi infiltrata nei germogli di end ana o nei giovani piantine di pomodoro mediante una siringa senza ago.Ciao, sono Andre Velazquez del laboratorio di Greg Martin del Dipartimento di Patologia Vegetale e Microbiologia Vegetale della Cornell University. Oggi vi mostreremo come eseguire il silenziamento genico indotto da virus in pomodoro e nicotiana. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le interazioni tra un patogeno vegetale e il suo ospite.Iniziamo. Per iniziare questa procedura per ceppi di agrobatterio fassan, cias

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Vi presentiamo il protocollo dettagliato per Agrobacterium mediata indotta da virus silenziamento genico (VIGS), saggio in cotone. Il virus crepitio del tabacco (TRV)-vettori derivati ​​VIGS sono stati schierati per indurre il silenziamento dell'RNA di cotone GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. Il fenotipo albino causati da tacere GrCLA1 ​​è stata osservata nella fase piantina entro 2 settimane dopo l'inoculazione.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Fonte: Shi, J., et al. Screening e identificazione dei soppressori silenzianti dell'RNA da effettori secreti di patogeni vegetali. J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra un saggio di coinfiltrazione per identificare proteine effettrici patogene che sopprimono il silenziamento dell'RNA in Nicotiana benthamiana 16c. Un reporter fluorescente e un gene candidato effettore vengono introdotti nelle foglie delle piante tramite Agrobacterium. Normalmente, il silenziamento dell'RNA degrada i...

Test di coinfiltrazione per lo screening degli effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l'uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell'identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Qui, presentiamo un metodo versatile per la trasformazione della radice di pomodoro seguito da inoculazione con Ralstonia solanacearum per eseguire un'analisi genetica semplice per lo studio della malattia dell'avvizzimento batterico.

Trasformazione della radice di pomodoro seguita da inoculazione con Ralstonia Solanacearum per un'analisi genetica diretta della malattia batterica di Wilt

Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell'RNA negli agenti patogeni delle piante.

Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

Qui presentiamo il primo protocollo per l'infiltrazione sottovuoto localizzata per studi in vivo della trasformazione genetica di piante di grandi dimensioni. Utilizzando questa metodologia, abbiamo ottenuto per la prima volta la trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta .

Agroinfiltrazione forzata sottovuoto per la trasformazione in planta di piante recalcitranti: il cacao come caso di studio

Impara il silenziamento genico virale (VIGS) per studiare la funzione genica in Nicotiana benthamiana e pomodoro. Questo metodo consente il knock-down transitorio dell'espressione genica mediante infiltrazione batterica.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

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