Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

In questo articolo, abbiamo descritto un modo tipico per isolare e cultura miociti adulti cuore di ratto. Collagenasi e proteasi sono utilizzati da digerire e isolare singoli miociti. Miociti colto seguire questo protocollo soddisfare le esigenze più sperimentare.

La procedura inizia con l'asportazione del cuore da un ratto adulto e l'appenderlo al sistema di perfusione. Le soluzioni enzimatiche vengono lasciate perfondere per circa 30 minuti, dopodiché il cuore viene rimosso. La digestione macinata ed enzimatica ha permesso di continuare in un piccolo becher.

Al termine della digestione, le cellule vengono dissociate in una sospensione di una singola cellula mediante agitazione meccanica e filtrate in una provetta sterile. Le cellule cardiache primarie vengono lavate tre volte in tamponi con concentrazione di calcio crescente, risospese in coltura, terreno e piastrate su piastre di coltura tissutale rivestite in laminato. Ciao, sono Shahi del laboratorio di Henry Cowa presso il Dipartimento di Fisiologia e Fisica Cellulare della Columbia University.

Oggi vi mostreremo una procedura per isolare e coltivare altre cellule cardiache di ratto. Usiamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i canali del calcio nel cuore. Quindi iniziamo.

Il giorno prima dell'intervento chirurgico sul ratto assicurarsi che tutte le soluzioni siano pronte, ma non aggiungere ancora alcun enzima. I tamponi a B e il tampone di lavaggio devono essere filtrati per la sterilità prima della conservazione a quattro gradi Celsius. Anche il giorno prima devono essere piastrate sei piastre per coltura tissutale a pozzetti con una soluzione laminata e conservate a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2.

Il giorno dell'intervento. Preparare gli strumenti chirurgici igienizzando le pinze, le forbici e le pinze con etanolo al 70% e lasciarli asciugare su carta assorbente. Viene preparata una siringa da un millilitro riempita con mezzo millilitro di soluzione di eparina.

Ora è buona norma lavare l'apparato di perfusione che funziona con etanolo al 70% con la pompa peristaltica al contrario. Una volta terminato, risciacquare con etanolo, sciacquare l'apparecchio con acqua distillata doppia e infine risciacquare con il tampone A.Il flusso viene raccolto in un becher e posto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Per preparare l'apparato di profusione ripulito, riempire il tubo della siringa destro con 40 millilitri di tampone A e il tubo della siringa sinistro con 40 millilitri di tampone B.Adescare il tubo di perfusione sulla punta del catetere consentendo al tampone A di fluire attraverso l'apparato.

Riempire il tampone con una siringa fino al livello di 40 millilitri. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nel tubo dopo questo passaggio, ora chiudere il tampone, una siringa con la valvola del rubinetto di arresto e ripetere il processo in modo tale che il tubo di profusione sia ora innescato con il tampone B. L'apparato di profusione è finalmente pronto e viene lasciato con il tampone. B la valvola del rubinetto di arresto è aperta, ma il flusso è interrotto.

Utilizzando il regolatore sulla linea IV, scartare il flusso tampone nel becher di raccolta. L'ultima cosa da fare prima dell'intervento chirurgico è aggiungere gli enzimi necessari alla soluzione madre e quindi filtrare la soluzione enzimatica proprio come le altre soluzioni sono state filtrate il giorno prima. Una volta filtrata, questa soluzione può essere lasciata a temperatura ambiente seguendo il protocollo standard.

Eutanasia del ratto con isofluoro in una camera a gas. Igienizzare l'area dell'incisione sul torace con etanolo al 70%. Apri il torace usando le forbici ed esponi il cuore.

Iniettare nel ventricolo sinistro 0,5 millilitri di soluzione di eparina. Rimuovere il cuore con gran parte dell'aorta intatta. Inserire immediatamente il catetere nell'aorta.

Un tipico cuore di ratto dovrebbe produrre un'alta frazione di miociti sani a forma di bastoncino e poche cellule morte arrotondate. Se la seguente procedura è stata rispettata correttamente, per iniziare bloccare l'aorta al catetere. La punta del catetere non deve essere spinta troppo in profondità nel cuore per garantire una buona perfusione del cuore attraverso l'arteria coronaria.

Una volta bloccato, legare l'aorta al catetere con la sutura. Quindi, aprire il regolatore della linea IV per consentire una velocità di gocciolamento rapida e consentire all'ape tampone di lavare il cuore durante il lavaggio dell'ape tampone. Usa le piccole forbici e le pinze per rimuovere gli atri e qualsiasi tessuto adiposo o polmonare aggrappato al cuore.

Al termine del buffer B, passare il flusso al buffer per un po'. Il buffer A può fluire per cinque minuti. Riscaldare la soluzione enzimatica in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Quando il tampone A è esaurito dalla siringa ma ancora presente nel tubo, caricare 50 millilitri della soluzione enzimatica nella siringa A dell'apparato di profusione. A questo punto è necessario scartare tutto il flusso che passa dal becher di raccolta nel bagno d'acqua fino a quando la soluzione enzimatica non penetra nel cuore. Non appena la soluzione enzimatica penetra nel cuore, attivare la pompa peristaltica, che è impostata per trasferire la soluzione enzimatica dal becher di raccolta alla siringa rifornita.

A lasciare che la soluzione enzimatica fluisca attraverso il cuore per 10 minuti. Man mano che il cuore digerisce, inizia a sembrare gonfio a 37,5 microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 molare nella soluzione enzimatica nella siringa A per dare una concentrazione efficace di calcio 0,1 millimolare. Questa è la prima di diverse aggiunte di cloruro di calcio utilizzate per aumentare la concentrazione dopo 10 minuti, aumentare la concentrazione di calcio a 0,2 millimolari aggiungendo altri 50 microlitri di cloruro di calcio 0,1 molare alla siringa A e lasciare che la profusione proceda per altri 10 minuti.

Trascorsi 10 minuti, tagliare i ventricoli e trasferire il cuore in un piccolo becher sterile contenente 20 millilitri di soluzione enzimatica nel becher. Aumentare la concentrazione di calcio a 0,4 millimolari aggiungendo altri 40 microlitri di cloruro di calcio 0,1 molare, tritare delicatamente il cuore in 10 o più pezzi con un paio di piccole forbici sterili. Ora incubare il becher a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio.

Dopo cinque minuti di incubazione, aggiungere 40 microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 per ottenere una concentrazione efficace di 0,6 millimolari di calcio e iterare delicatamente i pezzi di cuore con una pipetta di trasferimento in plastica da tre a cinque volte dopo l'incubazione per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 40 microlitri di cloruro di calcio molare 0,1 molare e iterare delicatamente come prima. Utilizzare un filtro sterile da 500 micrometri per separare i singoli miociti digeriti dal tessuto connettivo non digerito. Lasciare riposare le cellule in una provetta da 50 millilitri per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante con un VI di trasferimento. Risospendere delicatamente le cellule nel tampone di lavaggio numero uno e lasciare che le cellule si depositino per 10-20 minuti a temperatura ambiente mentre le cellule si stanno depositando.

Prelevare una piccola aliquota e utilizzare questo tempo come un'opportunità per valutare la qualità e la vitalità delle cellule in sospensione al microscopio invertito. Una buona preparazione avrà un'alta percentuale di cellule a bastoncino con striature nitide. Una volta che le cellule si sono depositate, scartare la laccia e risospendere delicatamente le cellule nel tampone di lavaggio.

Numero due, lasciare che le cellule si depositino a temperatura ambiente, il che dovrebbe richiedere nuovamente dai 10 ai 20 minuti e scartare il surnatante. Risospendere delicatamente le cellule in un terreno di siero al 5% prima di trasferire le cellule su piastre di coltura tissutale. Lavare le piastre con un XSFM.

Trasferire le cellule alla densità desiderata e incubarle in un incubatore per colture tissutali a CO2. Per tre-cinque ore, passare il terreno a uno XSFM Le cellule possono essere coltivate per un massimo di quattro giorni e utilizzate secondo necessità per gli esperimenti. Dovrebbe esserci più del 70% di miociti cardiaci vivi al microscopio invertito quando il protocollo viene eseguito correttamente.

Si tratta di miociti isolati trasfettati con YFP REM dopo essere stati coltivati per 48 ore. Le cellule di questa qualità vengono tipicamente coltivate da questa procedura. Ti mostreremo solo come isolare e la coltura sono quelle cellule calde.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere il più veloci e puliti possibile. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.