Name: Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dellOrgano murini di Corti. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Scopri la coltura primaria e l'elettroporazione plasmidi dell'organo di Corti murino. Questo metodo consente l'espressione genica in vitro per studiare la biologia cellulare uditiva e i meccanismi della perdita dell'udito.

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Gli autori desiderano ringraziare Demêmes Danielle e Douglas Cotanche e per il loro impegno nella didattica noi i metodi per l&#39;isolamento di dell&#39;organo del Corti. Inoltre, vorremmo ringraziare Ismaele Stefanov-Wagner per la progettazione degli elettrodi elettroporatore; Sherry Lin per le sue opere d&#39;arte che contribuiscono alla animazione video, e Matteo Chana, Jason Meeker, Kendra e Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) per la produzione del video. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI supporto di base per Hearing Research) dal dell&#39;NIDCD.

Giorno 1. Sterilizzazione e rivestimento dei coprioggetto di vetro. <ol><li> Secco sterilizzare coprioggetto microscopio vetro in autoclave. </li><li> Posizionare il coprioggetto sterilizzato in due pozzetti di una pre-sterilizzati quattro ben piatto di coltura cellulare. </li><li> Rivestire il coprioggetto con 1:1 poli-L-ornitina e laminina integrato con il 20% siero fetale bovino (FBS) notte a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> 400 microlitri poli-L-ornitina (soluzione 0,01% conservati a 4 ° C) </li><li> Laminina 400 microlitri (50 mg / ml soluzione stock conservato in aliquote a -20 ° C) </li><li> FBS 200 microlitri (conservato in aliquote a -20 ° C) </li></ol></li><li> Calore sterilizzare gli strumenti dissezione durante la notte in un 150 ° C incubatore. </li><li> Fai terreno di coltura contenente 10% siero e 10 mg / ml ampicillina. <ol class="lalpha"><li> 90 mL di coltura Dulbecco modificato Aquila Media </li><li> 5 FBS mL (conservato in aliquote a -20 ° C) </li><li> 5 ml siero di cavallo (conservato in aliquote a -20 ° C) </li><li> 10 L ampicillina (10 mg / ml soluzione madre conservato a 4 ° C) </li></ol></li></ol> 2 ° giorno. Isolamento dei dell'organo del Corti. <ol><li> Sterilizzare il positivo cofano dissezione flusso. <ol class="lalpha"><li> accendere la luce UV per 20 minuti </li><li> spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo e attendere 5 minuti prima dell'uso. </li></ol></li><li> Decapitare il mouse cucciolo (P4) alla base del forame magno con le forbici operativo. </li><li> Brevemente lavare la testa in 10 piatti cm contenente etanolo al 70%. </li><li> Rimuovere l'epidermide con un bisturi. </li><li> Aprire il cranio lungo la sutura sagittale con una lama di bisturi e poi dividono in due la proencefalo. Conservare la proencefalo caudale per la dissezione ulteriormente. </li><li> Rimuovere l', cervelletto e tronco encefalico proencefalo con dissezione smussa. </li><li> Togliere le ossa temporali (fig. 2A), passarli brevemente in etanolo al 70%, e trasferirli in un piatto contenente 3 millimetri HBSS sterile. </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere la bulla e il tessuto circostante dalla parte petrosa dell'osso temporale. </li><li> Individuare la conchiglia a forma di chiocciola (fig. 2B) e separarla dal sistema vestibolare con pinze. </li><li> A questo stadio di sviluppo, il labirinto osseo non è completamente calcificato ed è facilmente sezionato con pinze. Rimuovere il labirinto osseo della coclea per separazione attento a partire dalla fine basale e lo spostamento apicale con pinze. </li><li> Il legamento spirale e organo di Corti è collegato a spirale lungo la spirale del modiolus (fig. 2C). Rimuovere con attenzione dell'organo del Corti, garantendo il legamento spirale nella regione gancio della base con pinze e lo svolgimento come ci si sposta apicalmente. </li><li> Partendo dalla base, rimuovere il legamento spirale dalla dell'organo del Corti con una pinza sottile # 55 (fig. 2D). Micro-isolamento dell'organo di epitelio sensoriale Corti (opzionale). </li><li> Rimuovere l'organo del Corti regione gancio della base con due siringhe da insulina ½ cc con permanentemente attaccato U-100 28G ½ aghi pinze. </li><li> Partendo dal vertice, togliere la spirale limbus dalla fila di cellule ciliate interne e procedere basale (fig. 2E-F). Placcatura dell'organo del Corti espianto </li><li> Rimuovere la soluzione poly-L-ornithine/laminin/FBS dai pozzetti cultura e aggiungere 130 ml di terreno di coltura. </li><li> Trasferire l'organo di Corti sezionato al coprioggetto vetro rivestito nella cultura bene e orientare l'espianto in modo che le ciglia delle cellule dei capelli sono verso l'alto. </li><li> Rimuovere il supporto nella cultura e con una pipetta 200 microlitri. Assicurarsi che la membrana basilare entra in contatto solido con il coprioggetti vetro rivestito. </li><li> Aggiungere con cautela 130 ml di terreno di coltura per l'organo di Corti con una pipetta 200 ml. Applicare due gocce sulla superficie dell'organo del Corti e poi aggiungere lentamente il restante volume a lato del coprioggetto. Assicurarsi che l'organo del Corti non galleggia nei terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2. </li></ol> 3 ° giorno. Elettroporazione del gene reporter in organo colta di Corti. <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura dall'organo della cultura Corti. </li><li> Aggiungere 130 microlitri di H 2 O per 1 minuto e poi rimuovere con una pipetta 200 microlitri. </li><li> Aggiungere 30 ml di giornalista DsRed plasmide (2 mg / mL H 2 O conservati a -20 ° C). </li><li> Anticipo gli elettrodi del elettroporatore utilizzando un micromanipolatore in modo che l'anodo unocatodo ° sono su entrambi i lati della cultura. </li><li> Generare un impulso (27V, 30 ms di durata, 10 treni di impulsi) per electroporate il gene reporter nell'organo della cultura Corti espianto. <ol class="lalpha"><li> Opzionale: invertire la polarità dell'impulso per garantire elettroporazione del transgene su entrambi i lati e modiolar spirale legamento del espianto. </li></ol></li><li> Attendere 5 min. </li><li> Aggiungere 130 microlitri della Fugene 6: soluzione di DNA (3 parti Fugene a 2 parti di DNA). Questa soluzione deve essere preparata prima dell'inizio della procedura di elettroporazione (passo 20) con un rotondo 3 ml fondo in polistirene di prova in una cappa a flusso laminare. Per rendere questa soluzione: <ol class="lalpha"><li> Aggiungere 2,4 ml di Opti-MEM (conservato a 4 ° C) per la provetta. </li><li> Aggiungere 0,6 ml di reagente Fugene 6 (conservato a 4 ° C) per la provetta. Assicurarsi di aggiungere il Fugene direttamente al Opti-MEM ed evitare il contatto diretto con i lati della provetta. </li><li> Vortex per 1 secondo. </li><li> Incubare 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2,0 microlitri DsRed giornalista plasmide DNA a doppia elica (conservati a -20 ° C a 100 DNA mg / ml aliquote H 2 O). </li><li> Vortex per 1 secondo. </li><li> Incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 200 ml di terreno di coltura. </li><li> Vortex per 1 secondo. </li></ol></li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura alla cultura bene e incubare per 37 ° C per un massimo di 10 giorni. </li></ol> Rappresentante Risultati Vi presentiamo un metodo per l'isolamento dell'organo del Corti da un mouse perinatale. La procedura può essere utilizzata per topi giovani come il giorno embrionale 16 fino a circa 6 giorni dopo la nascita, momento in cui il labirinto osseo diventa sufficientemente calcificate a rendere la dissezione ingombrante. Una volta che l'organo del Corti è sezionato, può essere placcato e colto nella sua interezza (fig. 3) o come micro-isolati epitelio sensoriale (fig. 4). Abbiamo inoltre presentato una tecnica di esprimere geni esogeni nell'organo colta di Corti. La cultura organotipica è utile per molti altri tipi di studio, come l'analisi di organo del Corti genica mediante RT-PCR o ibridazione in situ, organo del Corti co-coltura con cellule gangliari a spirale o cellule staminali esogene utilizzando il micro-isolare 3, o in analisi in vitro di morte delle cellule e la rigenerazione dei capelli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"></a> Figura 1. Sezione dell'organo P4 murino di Corti. (A) Una sezione trasversale a cavallo basale di una coclea cryosectioned ottenuto da un topo P4 illustra le strutture generali della coclea murino descritto in questo protocollo. I media scala è delimitato dal legamento spirale e stria vascularis lateralmente, la membrana del Reissner s superiormente, la spirale limbus medialmente, e la membrana basilare inferiormente. La casella indicata la regione espansa in B. (B) L'organo del Corti si trova sul lato superiore della membrana basilare e comprende una fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne, e le loro rispettive cellule di sostegno. Linea tratteggiata 1 indica la posizione lungo la membrana basilare che viene rimosso durante questo organo di dissezione Corti. 2 linea tratteggiata indica la posizione lungo la membrana basilare che viene rimosso durante la micro-procedura di isolamento. Verde indica l'etichettatura di immunoistochimica calbindin, che le etichette le cellule del limbus interdentale spirale, le cellule ciliate cocleari, i neuroni del ganglio spirale, così come le cellule del legamento spirale e vascularis 7 stria. DAPI etichettatura dei nuclei è in blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"></a> Figura 2. Organo di dissezione Corti. Immagini dal video che accompagna l'organo di evidenziare dissezione Corti A) il sistema di coclea e vestibolare situato all'interno dell'osso temporale isolato (rosso), B), il labirinto osseo della coclea, C) il legamento spirale e collegato organo del Corti dopo la rimozione del labirinto osseo, D) la rimozione del legamento spirale e stria vascularis (rosso) dal dell'organo del Corti, E) micro-isolamento dell'epitelio sensoriale dal limbo spirale (rosso), e F) il isolato spirale limbus (a sinistra) e l'epitelio sensoriale (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"></a> Figura 3. Colta organo di Corti espianto. DIC immagine che mostra l'organo diCorti di un Atoh1-nGFP topo P4 che è stato isolato, placcato, e colto per cinque giorni come descritto. Questo mouse è stato geneticamente modificato in modo che le cellule che esprimono la pro-capelli genica su cellule omologo Atonal 1 (aka Atoh1 Math1) mostrano una proteina verde fluorescente che è localizzato al nucleo 8. Gli organi di Corti da questi topi presentano un'etichetta nucleare GFP in tutti i nuclei delle cellule dei capelli e quindi permettono una facile visualizzazione dell'epitelio sensoriale utilizzando un microscopio epifluorescente. La relativamente grande spirale limbus può essere vista laterale per l'epitelio sensoriale. Cellule mesenchimali che hanno avuto origine dalla dell'organo del Corti sono emigrati lontano dal espianto. Blue Label nucleare è DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"></a> Figura 4. Micro-isolati epitelio sensoriale. Epifluorescente immagine ottenuto dal epitelio sensoriale che è stato isolato da un organo P4 murino di Corti come descritto e colto durante la notte. Il micro-ceppo è stato poi fissato nel 4% paraformaldeide e trattati per immunomarcatura della 7a miosina che le etichette cellule ciliate cocleari. Si noti l'assenza della spirale limbus comparativamente più dalla figura 3. Blue Label nucleare è DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"></a> Figura 5. Elettroporazione del gene reporter di DsRed nell'organo colta di Corti. Interi organi di Corti da P4 Atoh1-nGFP cuccioli di topo sono state isolate, placcato, e poi elettroporate con il gene reporter DsRed come descritto e quindi visualizzati sotto un microscopio epifluorescente. Cellule dell'organo di espianto Corti che hanno espresso la proteina transgenica giornalista DsRed cellule mostrano una fluorescenza rossa e endogena della mostra epitelio sensoriale una fluorescenza verde nucleare. Cellule transgeniche possono essere visti in tutto il limbus a spirale ed epitelio sensoriale.

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Ci sono molti dettagli che sono fondamentali per il successo di questa procedura. Minore è il tempo dall&#39;isolamento osso temporale per organo di incubazione Corti, maggiore è la possibilità che gli organi che attribuirà alla coprioggetto e risultato nelle culture degli organi vitali. Pertanto, è importante limitare la quantità di tempo che intercorre tra la dissezione e l&#39;immissione degli organi nell&#39;incubatrice. La scelta dell&#39;antibiotico è cruciale, dato che molti antibiotici aminoglicosidici sono ototossici e può provocare la morte delle cellule dei capelli. Anche se è preferibile rinunciare all&#39;uso di antibiotici del tutto, questo lascia aperta la possibilità di contaminazione. Pertanto, si consiglia l&#39;uso di 10 mg / ml ampicillina come regola generale per superare problemi di contaminazione potenziale. L&#39;aspetto più fastidioso di questa, e altre procedure per la coltura primaria dell&#39;organo del Corti, è la tendenza degli organi di galleggiare fuori i piatti durante l&#39;incubazione. Anche se le culture organo galleggiante possono rimanere vitali per 5-7 giorni, ci sono svantaggi di organi coltura galleggiante. Per esempio, culture d&#39;organo galleggiante spesso piega su se stessi dopo 4-5 giorni di rendering microscopia problematico. Successivamente, l&#39;integrità strutturale di un organo può diventare compromessa rispetto agli organi che sono stati apposti i coprioggetto. Abbiamo scoperto che le seguenti tecniche contribuirà ad assicurare che l&#39;organo del Corti non galleggia in terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto. In primo luogo, cappotto coprioggetto il vetro in 1:1 polyornithine / laminina integrata con 20% FBS come descritto. La notte di incubazione previsto dal presente protocollo è il tempo minimo che il piatto deve essere rivestita. Nel nostro laboratorio, abbiamo spesso strato tutti i piatti di cui abbiamo bisogno per una settimana e tenerli a 4 ° C fino al giorno prima dell&#39;uso quando li passare al incubatore per una notte di incubazione. In secondo luogo, dopo che gli organi sono trasportati al coprioggetto rivestito, orientare l&#39;espianto in modo che le ciglia delle cellule ciliate a faccia in su. Questo orientamento facilita l&#39;aderenza della membrana basilare per il piatto cultura. In terzo luogo, rimuovere il supporto all&#39;interno del pozzo di apporre l&#39;espianto al piatto rivestito. Questo garantirà il contatto tra il piatto della cultura e della membrana basilare e migliorare la capacità del espianti di aderire al vetro. Ciò contribuirà anche a mantenere l&#39;integrità strutturale del file di cellule ciliate. Infine, attenzione a goccia 2 gocce di terreno di coltura sulla superficie dell&#39;organo del Corti con una pipetta 200 microlitri capacità e poi, lentamente, riempire il pozzo da gocciolamento del volume residuo (del totale 130 mL) sul lato del coprioggetto. E &#39;importante lavorare rapidamente per assicurare l&#39;attaccamento dell&#39;organo del Corti alla coprioggetto rivestito. Dalla data di apertura della dissezione per l&#39;incubazione del espianti, che in genere dura 10 minuti per un operatore praticato per completare questa procedura di isolamento organo di Corti. In questo protocollo, si presentano anche un metodo per la micro-isolamento dell&#39;epitelio sensoriale dal limbo spirale dell&#39;organo del Corti. In questa procedura, il limbus spirale è sezionato dalla epitelio sensoriale utilizzando aghi 28G ½ insulina come strumenti di dissezione. La risultante micro-isolare costituito le file di cellule ciliate e le corrispondenti celle di supporto (fig. 3). L&#39;epitelio sensoriale isolato può essere colto come descritto in questo protocollo. Questo micro-isolamento procedura deve essere confrontata con la separazione enzimatica degli epiteli sensoriali dal tessuto circostante 4. Nei mammiferi, così come non-mammiferi specie come polli, digestione thermolysin di isolati risultati vestibolare organi nell&#39;isolamento degli epiteli sensoriali dalle cellule mesenchimali seminterrato 4. Nel ratto coclea, i risultati digestione thermolysin nella separazione della cresta epiteliale maggiore, minore cresta epiteliale e di accompagnamento epiteli sensoriali dalla membrana basale 5. Tuttavia, non è chiaro se l&#39;epitelio sensoriale cocleare possibile allegare alle piastre di rivestimento senza l&#39;accompagnamento delle cellule mesenchimali. Mentre sia la micro-meccanica e di isolamento metodo enzimatico risultato metodo della digestione, la separazione degli epiteli sensoriali dal limbo spirale, i vantaggi della micro-dissezione isolare il digestione thermolysin includere un protocollo relativamente più brevi, meno costosi reagenti, e lo stress potenzialmente meno di l&#39;espianto a causa degli effetti della digestione enzimatica. Inoltre, la membrana basale è lasciata intatta in questo approccio, che può aumentare l&#39;attaccamento dell&#39;epitelio sensoriale alla piastra di coltura. Gli svantaggi di questo metodo comprendono la necessità di sviluppare le competenze di questa delicata dissezione e potenziali danni meccanici per l&#39;epitelio sensoriale derivante dalla dissezione micro. Come esempio dell&#39;utilità di questa procedura, si presentano anche un esempio dell&#39;uso dell&#39;organo diCulture Corti, l&#39;elettroporazione di geni esogeni nella cultura espianto. La procedura sopra descritta elettroporazione si basa su precedenti metodi di elettroporazione organo del Corti. In particolare, Zheng e Gao (2000) descrivono l&#39;elettroporazione di organi isolati di ratto delle Corti dove si svolgono le espianti in vigore per l&#39;elettroporazione di una scanalatura di costruzione della agarosio e poi placcato sul collagene rivestito 8-scivolo LabTek bene in mezzo privo di siero 2. Un vantaggio di questo approccio è che gli organi sono orientate in modo che la superficie superiore del espianti faccia il catodo, che teoricamente dovrebbe portare a una distribuzione uniforme delle cellule elettroporate attraverso l&#39;espianto. Nelle nostre mani tuttavia, il metodo che descriviamo migliorato su questa procedura perché l&#39;organo del Corti è rimasto apposta sul coprioggetto durante tutta la procedura in modo da ridurre la manipolazione degli espianti dopo l&#39;elettroporazione. Inoltre, una percentuale più alta di organi di Corti rimasta unita al copri con questo metodo presentato. Il nostro metodo è tratto da Jones et al. (2006) che utilizza l&#39;aggiunta della Fugene 6 reagente per aumentare l&#39;efficienza di espressione genica dopo l&#39;elettroporazione. Nel Jones et al. (2006) il protocollo, gli organi sono elettroporate, incubate per 5 minuti con 100 ml di Fugene 6 reagenti di trasfezione, e placcato 6. Il nostro metodo si differenzia per l&#39;uso di un rapporto 3:2 di Fugene 6 reagente al DNA plasmide, che abbiamo trovato empiricamente per fornire ottimale espressione transgenici con minima tossicità d&#39;organo. Non usiamo puro Fugene 6 reagente, il che può causare tossicità per le colture. La configurazione degli elettrodi nel nostro protocollo, così come Jones et al. (2006), si traduce in espressione genica primario sia la spirale limbus o epitelio sensoriale a seconda della posizione del catodo. Anche se ci sono DsRed cellule positive sul versante della cultura distante verso il catodo, vi è una maggiore concentrazione di cellule transgeniche più vicino al catodo. Per assicurare una completa espressione del transgene in entrambi i lati dell&#39;organo del Corti espianto, la corrente può essere invertita per un treno di impulsi secondo semplicemente invertendo i cavi. I risultati presentati in protocollo l&#39;espressione del transgene robusta in tutto l&#39;organo del Corti (fig. 5).

<table><tbody><tr><td>Coverslip di vetro per microscopio</td><td>DYNALAB Corporation</td><td>2010</td><td>diametro 10 mm, cerchio #1, spessore 1 mm, 1 oncia</td></tr><tr><td>Piastra da coltura cellulare con 4 anelli</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td>Piastra da coltura cellulare sterilizzata 35 X 10 mm con 4 anelli interni</td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Soluzione allo 0,01%</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td>prodotto in topo</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>26140-095</td><td>qualificato</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td>Dritte, affilate-smussate, lunghezza 5&quot;</td></tr><tr><td>Lama per bisturi #11</td><td>BD Biosciences</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette #4 Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette fini #55 Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di coltura Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium </td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td>Alta concentrazione di glucosio</td></tr><tr><td>Siero equino</td><td>Invitrogen</td><td>2605088</td><td>Inattivato termicamente</td></tr><tr><td>Sale sodico di ampicillina</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td>Irraggiato</td></tr><tr><td>Siringa Lo-Dose da &amp;frac12; cc per insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>329465</td><td>U-100 28G&amp;#189;</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Fugene 6</td><td>Roche Group</td><td>11-815-091-001</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polistirene</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-5A</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>The Baker Company (Stanford, ME)</td><td>Modello SG603a</td><td>SterileGARD III&lt;br/&gt;Advanced Class II&lt;br/&gt;Biological Safety Cabinet</td></tr><tr><td>Mezzo Opti-MEM I a ridotto contenuto di siero</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide reporter</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632539</td><td>pCMV DsRed-Express 2</td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Bio-Rad</td><td>165&amp;#8211;2662</td><td>BioRad Gene Pulser Xcell</td></tr></tbody></table>

cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;organo murini di corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In tutti i mammiferi, l&#39;epitelio sensoriale per audizione si trova lungo l&#39;organo spirale del Corti che risiede all&#39;interno della coclea conchiglia a forma dell&#39;orecchio interno (fig. 1). Cellule ciliate della coclea sviluppo, che sono le cellule mechanosensory del sistema uditivo, sono allineate in una fila di cellule ciliate interne e tre (nella base e la metà di giri) a quattro (nel giro apicale) file di cellule ciliate esterne che abbracciano la lunghezza del dell&#39;organo del Corti. Cellule ciliate trasdurre vibrazioni meccaniche suono indotto della membrana basilare in impulsi nervosi che il cervello può interpretare. La maggior parte dei casi di sordità neurosensoriale sono causati dalla morte o la disfunzione delle cellule ciliate cocleari. Uno strumento sempre più essenziale nella ricerca uditiva è l&#39;isolamento e la coltura in vitro di espianti di organi 1,2,9. Una volta isolato, il espianti possono essere utilizzati in diversi modi per fornire informazioni riguardanti normative, anomalo, o fisiologia terapeutico. Espressione genica, la motilità stereociglia, biologia cellulare e molecolare, nonché approcci biologici per la rigenerazione delle cellule dei capelli sono esempi di applicazioni sperimentali di organo del Corti espianti. Questo protocollo descrive un metodo per l&#39;isolamento e la cultura dell&#39;organo del Corti da topi neonati. Il video che accompagna include le direzioni a tappe per l&#39;isolamento dell&#39;osso temporale da cuccioli mouse e successivo isolamento della coclea, legamento spirale, e organo di Corti. Una volta isolata, l&#39;epitelio sensoriale può essere placcato e coltivate in vitro nella sua interezza, o come un ulteriore sezionato micro-isola che manca la spirale limbo e dei neuroni del ganglio spirale. Usando questo metodo, gli espianti primari può essere mantenuta per 7-10 giorni. Come esempio dell&#39;utilità di questa procedura, organo del Corti espianti sarà elettroporate con un gene esogeno giornalista DsRed. Questo metodo fornisce un miglioramento rispetto ad altri metodi pubblicato in quanto fornisce indicazioni riproducibile, senza ambiguità e graduale per l&#39;isolamento, microdissezione, e la cultura primaria dell&#39;organo del Corti.

Questa procedura descrive un metodo per l&#39;isolamento e la cultura dell&#39;organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l&#39;espressione di un gene esogeno giornalista nell&#39;organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In tutti i mammiferi, l'epitelio sensoriale per l'udito è situato lungo l'organo del Corti a spirale, che risiede all'interno della cocleare a forma di conchiglia della ...

Ciao, sono Mark Parker. Benvenuti al laboratorio Eaton Peabody presso la Massachusetts Eye and Ear Infirmary di Boston, Massachusetts. Oggi presenteremo un protocollo per l'isolamento e la coltura primaria dell'organo marino di kti.Questo protocollo è fondamentale per il nostro lavoro perché consente l'analisi in vitro dell'organo essenziale per l'udito. Per evidenziare l'utilità di questo approccio, mostreremo anche uno dei numerosi utilizzi degli organi nel nostro laboratorio, ovvero l'elettroporazione di geni esogeni negli espianti coltivati. Cominciamo il lavoro.La procedura prevede i seguenti passaggi: i topi neonati verranno decapitati e i loro ossi temporali saranno rimossi mediante dissezione ottusa. Successivamente, la coclea verrà isolata dall'osso temporale utilizzando dissezione ottusa. Il labirinto osseo della coclea sarà quindi aperto con pinzette e il legamento spirale sarà rimosso dalla modiolus interna della coclea.Infine, il legamento spirale verrà separato dall'organo delle corde mediante pinzette; si potranno osservare delle rose traslucide di cellule ciliate disposte lungo tutta la lunghezza dell'organo di kti. Una porzione della membrana del RISE, che è stata rotta durante la rimozione del legamento spirale, è visibile lungo il lato modiulare. A titolo esemplificativo dell'utilità di questa procedura, degli espianti dell'organo delle corde verranno coltivati per 24 ore e successivamente elettroporati con un gene reporter fluorescente esogeno.I primi passaggi di questa procedura prevedono la preparazione delle piastre di coltura. Posizionare un'ansa di vetro sterilizzata, conservata in etanolo al 70%, in due pozzetti di una piastra per colture cellulari da quattro pozzetti sterilizzata in precedenza. Utilizzare soltanto due dei quattro pozzetti permette di limitare il tempo di permanenza delle colture fuori dal contenitore dell'incubatrice.Le lamelle con la soluzione costituita da poli-L-ornitina e laminina in rapporto uno a uno. Aggiungere il 20% di siero fetale bovino, posizionare la piastra di coltura all'interno di una piastra più grande da 10 centimetri per facilitarne il trasferimento e quindi incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Infine, sterilizzare per calore, cioè gli strumenti da taglio, in un incubatore a 150 gradi Celsius per tutta la notte.Sterilizzare l'incubatore a flusso laminare positivo attivando la luce UV per 20 minuti prima dell'inizio della dissezione. Sterilizzare lo spazio di lavoro all'interno dell'incubatore spruzzando tutte le superfici con etanolo al 70%. Posizionare la testa di un topo neonato decapitato in una piastra di Petri contenente etanolo al 70% e quindi rimuovere l'epidermide utilizzando una lama di bisturi.Aprire il cranio lungo la sutura sagittale utilizzando una lama di bisturi e quindi dividerlo a metà per il cervello. Conservare il proencefalo per ulteriori dissezioni. Rimuovere il proencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico mediante dissezione ottusa.Osservare la posizione dell'osso temporale di forma parametale sulla faccia laterale inferiore del cranio. Trasferire le ossa TAL in una capsula Petri da tre millimetri contenente soluzione salina sterile di Hank. Il resto della dissezione deve essere eseguito al microscopio da dissezione.Rimuovere eventuali tessuti circostanti dall'osso temporale. Individuare la coclea a forma di conchiglia ed estrarla dal sistema vestibolare utilizzando pinzette. In questa fase dello sviluppo, il labirinto osseo non è completamente calcificato ed è facilmente dissecabile.Rimuovere il labirinto osseo della coclea mediante una separazione accurata che inizi dall'estremità basale e proceda in direzione apicale. Utilizzando una pinzetta, rimuovere con cura il legamento spirale e l'epitelio sensoriale ad esso aderente dal modiolo, fissandolo nella regione del gancio alla base con la pinzetta e svolgendolo. Procedendo in direzione apicale, a partire dalla base, rimuovere il legamento spirale dall'epitelio sensoriale utilizzando una pinzetta fine numero 55.In alcuni dei nostri esperimenti, si desidera la rimozione del limbo spirale dall'epitelio sensoriale. In questa procedura di isolamento micro ol, l'organo del corti viene isolato dal limbo spirale utilizzando due siringhe per insulina da un mezzo cc come pinze. Innanzitutto, la regione a uncino dell'organo del corti viene rimossa utilizzando le siringhe per insulina.Successivamente, il limbo spirale viene separato dalla fila di cellule ciliate interne, partendo dall'apice e procedendo in direzione basale, oppure si isola l'intero organo del Corti con il limbo spirale ad esso attaccato. L'epitelio sensoriale microisolato o il limbo spirale microisolato possono essere coltivati come segue: rimuovere la soluzione di rivestimento dalle pozzette di coltura e sostituirla con 130 microlitri di mezzo di coltura contenente siero al 10%. Trasferire l'organo del Corti dissezionato sulla copertura di vetro rivestita all'interno della pozzetta di coltura. Abbiamo riscontrato che le seguenti tecniche aiutano a garantire che l'organo del Corti non galleggi nel mezzo di coltura, ma rimanga fissato al coprioggetto.Prima rivestire, come descritto, i coprivetri di vetro. In secondo luogo, rimuovere il mezzo per fissare l'esplan al piatto rivestito. Ciò garantirà il contatto tra la piastra di coltura e l'esplan X.In terzo luogo, orientare l'espianto in modo che le ciglia delle cellule ciliate siano rivolte verso l'alto. Questa orientazione favorirà l'adesione dell'espianto alla piastra di coltura. Infine, aggiungere 130 microlitri di mezzo di coltura con siero mediante una pipetta da 200 microlitri, lasciando cadere con attenzione due gocce sulla superficie dell'organo, quindi aggiungere lentamente il volume rimanente lungo il lato del pozzetto. Spostare con cura l'espianto in un incubatore e incubare a 37 gradi Celsius in presenza di 5% di anidride carbonica.Queste colture possono essere mantenute per sette-dieci giorni. Esistono numerose applicazioni per l'organo di Corti isolato. Alcuni esempi includono l'analisi dell'espressione genica mediante R-T-P-C-R o ibridazione NC due, la coltura dell'organo di Corti con cellule del ganglio spirale o cellule staminali esogene, oppure l'analisi *in vitro* della morte delle cellule ciliate. Per dimostrare l'utilità di questa procedura, vi mostreremo una tecnica comunemente utilizzata nel nostro laboratorio per esprimere geni esogeni nelle colture di espianato.Per questa dimostrazione, l'organo del Corti isolato verrà elettroporato con un vettore di espressione che esprime costitutivamente il gene reporter DS red. Dopo l'elettroporazione, le colture saranno incubate con un reagente di trasfezione Gene Six per 24 ore al fine di potenziare la procedura di trasfezione. Utilizzando questo sistema, le cellule trasfettate mostreranno una fluorescenza rossa citoplasmatica entro 24 ore.Preparare innanzitutto un rapporto da tre a due di reagente per la trasfezione del gene FU6 rispetto al DNA bersaglio in un tubo da prova in polistirene rotondo da tre millilitri. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il mezzo di coltura dall'organo di coltura. Aggiungere 130 microlitri di acqua per un minuto, quindi rimuoverli utilizzando una pipetta con capacità di 200 microlitri.Successivamente, aggiungere 30 microlitri del plasmide reporter DS rosso, conservato in una soluzione stock di due milligrammi di DNA plasmidico per millilitro di acqua. Per l'elettroporazione, utilizziamo un BioRad gene Pulser Excel per generare l'impulso elettrico. Gli elettrodi sono stati personalizzati dal nostro laboratorio meccanico per soddisfare le nostre esigenze; consistono in fili nudi piegati ad angolo retto e schiacciati in una forma simile a una pagaia.Avanzare gli elettrodi dell'elettro utilizzando un micromanipolatore in modo che l'anodo e il catodo si trovino su lati opposti della coltura. Generare 10 treni di impulsi costituiti da 27 volt e di durata di 30 millisecondi per elettroporare il gene reporter nella coltura di organi in accordo con l'esperimento. Attendere quindi cinque minuti.Successivamente, aggiungere 130 microlitri della soluzione di DNA del gene FU sei all'espianto e quindi incubare a 37 gradi Celsius in presenza di 5% di anidride carbonica per tutta la notte. Il giorno successivo aggiungere due millilitri di siero al mezzo di coltura in ciascuna piastra. Le colture degli espianti possono essere mantenute per sei o più giorni dopo 24 ore.Le cellule trasfettate possono essere osservate utilizzando un filtro SI a tre canali su un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza. Vi abbiamo appena mostrato un metodo per l'isolamento e la coltura primaria dell'organo del Corti. Questo metodo funziona con topi giovani fino al giorno embrionale 16 fino al giorno postnatale, momento in cui la coclea diventa sufficientemente calcificata da rendere difficoltosa la dissezione.Inoltre, abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione di geni esogeni nell'organo coltivato di corde. Questo rappresenta un esempio di un tipo di esperimento che può essere condotto sull'esplan coltivato. Senza dubbio, questa tecnica ha numerose applicazioni.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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