Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell'Organo murini di Corti.

Ciao, sono Mark Parker. Benvenuti al Laboratorio Eaton Peabody presso il Massachusetts Eye and Ear Infirmary di Boston, Massachusetts. Oggi presenteremo un protocollo per l'isolamento e la coltura primaria dell'organo marino del kti.

Questo protocollo è fondamentale nel nostro lavoro perché permette l'analisi in vitro dell'organo indispensabile per l'audizione. Per evidenziare l'utilità di questo approccio, dimostreremo anche uno dei tanti usi degli organi nel nostro laboratorio, l'elettroporazione di geni esogeni negli espianti in coltura. Mettiamoci al lavoro.

Lo schema di questa procedura è il seguente, i topi neonatali saranno decapitati e le loro ossa temporali rimosse utilizzando la dissezione contundente. Successivamente, la coclea verrà isolata dall'osso temporale mediante dissezione contundente. Il labirinto osseo della coclea verrà quindi aperto utilizzando una pinza e il legamento spirale verrà rimosso dal modis interno della coclea.

Infine, il legamento spirale verrà separato dall'organo del cordone utilizzando una pinza, si possono vedere rose traslucide di cellule ciliate che corrono lungo la lunghezza dell'organo di kti. Una parte della membrana del RISE, che è stata rotta durante la rimozione del legamento a spirale, può essere vista correre per tutta la lunghezza del lato modulare. Come esempio dell'utilità di questa procedura, gli espianti di corde d'organo saranno coltivati per 24 ore e poi saranno elettroporati con un gene reporter fluorescente esogeno.

Le fasi iniziali di questa procedura prevedono la preparazione delle piastre di coltura. Posizionare un vetrino di vetro sterilizzato che è stato conservato in etanolo al 70% in due pozzetti di una piastra di coltura cellulare a quattro anelli pre-sterilizzata. L'utilizzo di solo due dei quattro pozzetti limiterà la quantità di tempo in cui le colture sono fuori dal contenitore dell'incubatrice.

Il coperchio scivola con la soluzione costituita da poli-lornitina e lamina uno-a-uno. Integrato con il 20% di siero fetale bovino, ha posizionato la capsula di coltura all'interno di una piastra più grande di 10 centimetri per facilitarne il trasferimento e poi incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Infine, sterilizzare a caldo gli strumenti in un'incubatrice a 150 gradi Celsius durante la notte.

Sterilizzare la cappa di dissezione a flusso positivo accendendo la luce UV per 20 minuti prima dell'inizio della dissezione. Sterilizzare lo spazio di lavoro all'interno della cappa di dissezione spruzzando tutte le superfici con etanolo al 70%. Metti la testa di un cucciolo di topo decapitato in una capsula di Petri contenente il 70% di etanolo, quindi rimuovi l'epidermide usando una lama di bisturi.

Aprire il cranio lungo la sutura sagittale usando una lama di bisturi e poi dividere in due il cervello. Trattenere il proencefalo per un'ulteriore dissezione. Rimuovere il proencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico utilizzando la dissezione smussata.

Si noti la posizione dell'osso temporale a forma di parametallo sul lato laterale inferiore del cranio. Trasferisci le ossa TAL in un piatto da tre millimetri contenente una soluzione sterile di sale per matasse. La dissezione rimanente deve essere condotta al microscopio da dissezione.

Rimuovere qualsiasi tessuto circostante dall'osso temporale. Individuare la coclea a forma di conchiglia e rimuoverla dal sistema vestibolare utilizzando una pinza. In questa fase di sviluppo, il labirinto osseo non è completamente calcificato ed è facilmente sezionabile.

Rimuovere il labirinto osseo della coclea mediante un'attenta separazione iniziando dall'estremità basale e muovendosi apicalmente. Usando una pinza, rimuovere con cura il legamento a spirale e l'epitelio sensoriale attaccato dal modis fissandolo alla regione del gancio della base usando una pinza e srotolandolo. Mentre ti muovi verso l'alto Partendo dalla base, rimuovi il legamento spirale dall'epitelio sensoriale usando una pinza fine numero 55.

In alcuni dei nostri esperimenti, si desidera la rimozione del limbus a spirale dall'epitelio sensoriale. In questa procedura di micro olo isolato, l'organo di cordi viene isolato dal limbus a spirale utilizzando due siringhe da insulina da mezzo cc come pinza. In primo luogo, la regione dell'uncino del cordone dell'organo viene rimossa utilizzando le siringhe da insulina.

Successivamente, il limbus a spirale viene separato dalla fila di cellule ciliate interne a partire dall'apice e procedendo basalmente verso l'intero organo di Corte con annesso limbus a spirale. L'epitelio sensoriale microisolato o il limbus a spirale microisolato possono essere coltivati come segue, rimuovendo la soluzione di rivestimento dai pozzetti di coltura e sostituendola con 130 microlitri di terreno di coltura contenente il 10% di trasferimento di siero, l'organo sezionato della corda al vetrino di vetro rivestito nella coltura. Bene, abbiamo scoperto che le seguenti tecniche aiutano a garantire che l'organo di corti non galleggi nel terreno di coltura ma rimanga attaccato al vetrino coprioggetto.

Prima mano, il coperchio in vetro scivola come descritto. In secondo luogo, rimuovere il supporto per apporre l'explan sul piatto rivestito. Ciò garantirà il contatto tra la piastra di coltura e la spiegazione X.

In terzo luogo, orientare l'explan in modo che le ciglia delle cellule ciliate siano rivolte verso l'alto. Questo orientamento faciliterà l'aderenza dell'explan al piatto colto. Infine, aggiungere 130 microlitri di terreno di coltura del siero utilizzando una pipetta da 200 microlitri, facendo gocciolare con cura due gocce sulla superficie dell'organo e quindi aggiungendo lentamente il volume rimanente sul lato del pozzetto, spostare con cautela l'explan in un incubatore e quindi incubare a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica.

Queste colture possono essere mantenute da sette a 10 giorni. Alcuni esempi includono l'analisi dell'espressione genica mediante ibridazione R-T-P-C-R o NC two, la coltura di organo cortico con cellule gangliari spirali o cellule staminali esogene o l'analisi in vitro della morte delle cellule ciliate. Per dimostrare l'utilità di questa procedura, vi mostreremo una tecnica comunemente utilizzata nel nostro laboratorio per esprimere geni esogeni nelle colture explan.

Per questa dimostrazione, l'organo isolato di corti sarà elettro parade con un vettore di espressione che esprime costitutivamente il gene reporter rosso DS. Dopo l'elettroporazione, le colture saranno incubate con un reagente di trasfezione di pochi geni sei per 24 ore per migliorare la procedura di trasfezione. Utilizzando questo sistema, le cellule trasfettate mostreranno una fluorescenza rossa citoplasmatica entro 24 ore.

Innanzitutto, preparare un rapporto tre a due del reagente di trasfezione del gene FU sei per il DNA bersaglio in una provetta di polistirene a fondo tondo da tre millilitri. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il terreno di coltura dall'organo di orticoltura. Aggiungere 130 microlitri di acqua per un minuto e poi rimuovere utilizzando una pipetta da 200 microlitri.

Successivamente, aggiungere 30 microlitri di plasmide reporter rosso DS, che viene conservato in una soluzione madre di due milligrammi di DNA plasmidico per millilitro di acqua. Per l'elettroporazione, utilizziamo un BioRad gene Pulser Excel per generare l'impulso elettrico. Gli elettrodi sono stati personalizzati dalla nostra officina meccanica per soddisfare i nostri scopi, gli elettrodi sono costituiti da filo nudo che è piegato con un angolo di 90 gradi e sono stati crimpati a forma di paletta.

Far avanzare gli elettrodi dell'elettro utilizzando un micro manipolatore in modo che l'anodo e il catodo si trovino su entrambi i lati della coltura. Genera 10 treni di impulsi costituiti da 27 volt e una durata di 30 millisecondi per elettropurificare il gene reporter nella cultura explan dell'accordo dell'organo. Quindi attendi cinque minuti.

Successivamente, aggiungere 130 microlitri della soluzione di DNA del gene FU sei alla spiegazione, quindi incubare a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno successivo aggiungere due millilitri di siero alla coltura, terreno a ciascuna piastra. Le colture explan possono essere mantenute per sei o più giorni dopo 24 ore.

Le cellule trasfettate possono essere visualizzate utilizzando un filtro SI three su un microscopio epi fluorescente. Vi abbiamo appena mostrato un metodo per l'isolamento e la coltura primaria dell'organo Corte. Questo metodo funziona con topi di età compresa tra il 16° giorno embrionale e il giorno postnatale, a quel punto la coclea diventa sufficientemente calcificata da rendere ingombrante la dissezione.

Inoltre, abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione di geni esogeni nell'organo coltivato del corde. Questo è un esempio di un tipo di esperimento che può essere condotto sulla piattaforma coltivata. Senza dubbio ci sono una moltitudine di usi per questa tecnica.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.