Acquisizione, elaborazione e analisi di ¹differenza di trasferimento di saturazione (STD) NMR per caratterizzare le interazioni proteina-glicano

Iniziare preparando un campione con un complesso proteina-ligando. Quindi, utilizzando una pipetta, trasferire con cura 0,6 millilitri della soluzione preparata in una provetta NMR da cinque millilitri. Per impostare lo strumento NMR alla temperatura richiesta, utilizzare il comando EDT per aprire il monitor di controllo della temperatura e regolare la temperatura desiderata.

Quindi, posizionare il campione sullo scambiatore di campioni. Utilizzare un autocampionatore per inserire il campione nel magnete ed eseguire il comando sx, seguito dal numero di posizione, N, corrispondente alla posizione del tubo NMR nel vassoio dell’autocampionatore. Successivamente, il campione entra nel magnete NMR.

Per bloccare il segnale del solvente, digitare il comando di blocco e selezionare il solvente appropriato dal menu. Utilizzare il modulo automatico, atma, o il modulo manuale, atmm, per completare il processo di sintonizzazione e corrispondenza. Ora, utilizzando il comando topshim, avviare lo shimming automatico, quindi eseguire il comando pulsecal per determinare l’impulso di 90 gradi del protone.

Successivamente, crea un nuovo set di dati e carica la sequenza di impulsi STD NMR. Definire le frequenze di risonanza off e on per l’esperimento STD NMR nella voce FQLIST nella finestra ACQUPARS. Imposta la frequenza di risonanza off in una regione senza alcun segnale di ligando o protone proteico.

Quindi, scegli una frequenza di risonanza on in una regione spettrale priva di segnali di glicani. Definire l’impulso sagomato da utilizzare durante il tempo di saturazione nei parametri ACQUPARS della finestra ASED. Successivamente, impostare la lunghezza dell’impulso del protone a 90 gradi, regolare il tempo di saturazione totale e il ritardo di rilassamento a tre secondi.

Impostare il numero di scansioni su un multiplo di otto e le scansioni fittizie su otto. Quindi, imposta il numero di punti in F2 su 16K, 32K o 64K e F1 su due. Ora, utilizzando il comando automatico rga, impostare il guadagno del ricevitore per evitare l’overflow.

Calcola il tempo totale dell’esperimento utilizzando il comando dell’esperimento. Infine, utilizzare il comando zg per inviare l’esperimento per l’acquisizione. Dopo l’esperimento, eseguire la trasformata di Fourier del primo FID e selezionare la destinazione degli spettri elaborati.

Quindi, utilizzando il comando lb, regolare il fattore di allargamento della linea. Per sfasare manualmente lo spettro, accedere alla scheda processo, quindi al sottomenu di regolazione della fase. Fare clic e trascinare sul pulsante corrispondente per eseguire correzioni dello zero e del primo ordine e salvare i risultati della fase.

Dopo aver eseguito la trasformata di Fourier per il secondo esperimento, salvare lo spettro elaborato con un codice diverso. Caricare i due spettri elaborati con le funzioni multiple e, utilizzando il pulsante di sottrazione disponibile nella visualizzazione multipla, sottrarli. Quindi, aprire lo spettro di risonanza off ed eseguire il comando MD per avviare la finestra di visualizzazione multipla.

Successivamente, caricare lo spettro STD. Successivamente, condurre un’analisi comparativa delle frequenze e delle intensità dei segnali presenti nello spettro STD NMR. Nell’esperimento di risonanza off, misurare l’intensità del segnale.

Naviga nel menu per selezionare il processo, quindi integrare. Definisci attentamente le regioni di interesse e registra gli integrali in un file. Allo stesso modo, misurare le intensità nell’esperimento MRN STD, assicurandosi che vengano utilizzati parametri identici, e documentare questi integrali in un file separato.

In alternativa, i valori STD possono essere determinati confrontando le intensità del segnale tra gli spettri STD e quelli fuori risonanza. Per calcolare la STD relativa in percentuale, assegnare un valore del 100% al protone che mostra la massima intensità STD. Lo spettro NMR STD del protone per l’interazione della N-acetil lattosio ammina, con la galectina 7 umana, ha mostrato segnali NMR STD che indicano il legame.

Inoltre, sono apparsi segnali appartenenti ai protoni a stretto contatto con la proteina, permettendo la delineazione dell’epitopo di legame.