Impianto ecoguidato: una tecnica per impiantare cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico in un topo adulto

- L'ecografia fornisce immagini ad alta risoluzione che aiutano a impiantare le cellule tumorali in un sito tissutale specifico con un'infiammazione minima durante l'iniezione delle cellule tumorali. In primo luogo, utilizziamo modelli ortotopici per innestare cellule tumorali in un organo rilevante di origine tumorale. L'organo imita il microambiente tumorale originale e facilita le metastasi.

Inizia sospendendo le cellule tumorali nel PBS freddo per mantenere il pH e posiziona la provetta sul ghiaccio. Quindi, posiziona il mouse anestetico sul tavolino ad ultrasuoni e fissa gli arti con del nastro adesivo. Applicare la quantità necessaria di gel per ultrasuoni sull'addome rasato e regolare la posizione della sonda ecografica fino a quando il pancreas non è chiaramente visibile. Caricare la siringa con la sospensione di cellule tumorali e iniettare con cura le cellule nel pancreas.

Nell'immagine ecografica appare una bolla di liquido, che conferma l'avvenuto impianto. Attendere 5 secondi per evitare il riflusso delle cellule e rimuovere delicatamente l'ago. Rimetti l'animale in una gabbia pulita e monitoralo fino a quando non si riprende dall'anestesia. Entro poche settimane dall'iniezione, le cellule tumorali iniettate nel pancreas si dividono rapidamente e formano un tumore. Nel seguente protocollo, eseguiremo l'impianto ecoguidato di cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico di derivazione murina nel pancreas del modello ortotopico.

- Prima di iniziare la procedura, risospendere la linea cellulare di adenocarcinoma duttale pancreatico di interesse in un volume appropriato di PBS freddo sterile su ghiaccio. Posizionare le gabbie su una piastra riscaldante a 37 gradi Celsius e pulire accuratamente la cabina di sicurezza biologica, la camera di induzione e il tavolino a ultrasuoni con uno sterilizzante appropriato. Impostare la funzione di riscaldamento del tavolino a ultrasuoni a 37 gradi Celsius e, dopo l'induzione dell'anestesia, applicare un unguento sugli occhi del primo animale.

Posizionare il mouse in decubito dorsale sul tavolino ad ultrasuoni e fissare delicatamente gli arti superiore e inferiore al tavolino con il nastro. Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per applicare uno strato generoso di crema depilatoria sul quadrante superiore sinistro dell'addome sopra la regione della milza fino alla linea mediana. Dopo 1 minuto, utilizzare una garza asciutta per rimuovere delicatamente i peli prima di rimuovere la crema depilatoria in eccesso con la garza salina umida. Quindi, posiziona il mouse in una delle nuove gabbie pulite sullo scaldino.

Per l'impianto di cellule tumorali ecoguidate, regolare la piattaforma ecografica in modo che la superficie sia parallela al pavimento e posizionarsi sul lato sinistro dell'animale con la testa del topo rivolta a destra. Regolare la posizione del trasduttore in modo da ottenere un'immagine addominale trasversale e fissare gli arti del mouse alla piattaforma con del nastro adesivo. Abbassare delicatamente il trasduttore fino a toccare l'addome del topo e regolare il trasduttore fino a quando il pancreas non è chiaramente visibile. Localizzare il rene sinistro e la milza per fornire un orientamento accurato nella cavità addominale.

Quando il sito di iniezione è stato individuato, caricare una siringa da insulina da 29 gauge da mezzo pollice con 25 microlitri di sospensione di cellule tumorali e pulire la punta dell'ago con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol. Utilizzare una pinza a lama smussata per afferrare la pelle del topo e la parete peritoneale per aumentare la tensione nel sito di iniezione. Tenendo la siringa a un angolo di circa 25-45 gradi rispetto alla superficie della piattaforma ecografica, far avanzare lentamente l'ago attraverso la pelle e la parete peritoneale. Verificare che l'ago sia perforato attraverso la parete peritoneale prima di utilizzare la visualizzazione ecografica per guidare l'ago direttamente nel pancreas.

Quando l'ago è in posizione, iniettare lentamente le cellule tumorali. La formazione di un bolo di liquido all'interno del pancreas sarà evidente in un pancreas correttamente iniettato mediante ultrasuoni. Una volta che l'intero volume della sospensione è stato iniettato e un bolo di liquido può essere osservato mediante ecografia, tenere la siringa molto ferma per alcuni secondi prima di ritrarre lentamente l'ago dall'addome del topo, facendo attenzione a non disturbare le cellule iniettate. Quindi, posizionare il mouse in una nuova gabbia pulita sullo scaldino con monitoraggio fino al completo recupero.

- Il corretto posizionamento dell'ago nel pancreas, compresa la profondità e l'angolo dell'ago, è un passaggio fondamentale in questo protocollo. La visualizzazione del bolo fluido aiuta a confermare l'avvenuta iniezione del tumore. Il controllo della profondità di iniezione è l'aspetto più difficile. Il mio consiglio è di esercitarsi con le iniezioni di tripano-blu e confermare il bolo di liquidi sia con l'ecografia che con l'autopsia.