Name: Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-21T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Scopri la tecnica dei micro-esplanti per isolare cellule staminali del muscolo scheletrico da tessuti di topi adulti ed embrioni. Questo metodo consente di studiare la rigenerazione muscolare e le potenziali applicazioni terapeutiche in medicina rigenerativa.

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Ringraziamo Patrick Paddison per il dono del vettore navetta shRNAi. Angela Sloan ha generato l&#39;immagine GFP RNAi in Figura 3. Ringraziamo anche gli organi di finanziamento per il loro sostegno i seguenti: Distrofia muscolare Campagna numero concedere RA2/592/2; SCINTILLE codice di autorizzazione 02BHM04, La Royal Society codice di autorizzazione 574006.G503/1948./JE e BBSRC codice di autorizzazione 6/SAG10077.

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<li>Zammit, P. S., Heslop, L., Hudon, V., Rosenblatt, J. D., Tajbakhsh, S., Buckingham, M. E., Beauchamp, J. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+myoblast+proliferation+show+that+resident+satellite+cells+are+competent+to+fully+regenerate+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetics of myoblast proliferation show that resident satellite cells are competent to fully regenerate skeletal muscle fibers.</a> Exp Cell Res. 281, 39-49 (2002).</li>
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<li>Shainberg, A., Yagil, G., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myogenesis+in+vitro+by+Ca2%2B+concentration+in+nutritional+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Control of myogenesis in vitro by Ca2+ concentration in nutritional medium.</a> Exp Cell Res. 58, 163-167 (1969).</li>
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<li>Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Growth+factors%2C+ubiquitin+and+apoptosis+in+dystrophic+muscle%3A+Apoptosis+declines+with+age+in+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22B+Appl+Myol%22%5BJournal%5D)">Muscle Growth factors, ubiquitin and apoptosis in dystrophic muscle: Apoptosis declines with age in the mdx mouse.</a> B Appl Myol. 6, 279-284 (1996).</li>
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<li>Smith, J., Schofield, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+an+mdx+skeletal+muscle+cell+line+into+dystrophic+%28mdx%29+skeletal+muscle%3A+evidence+for+stem+cell+status%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Stable integration of an mdx skeletal muscle cell line into dystrophic (mdx) skeletal muscle: evidence for stem cell status.</a> Cell Growth Differ. 8, 927-934 (1997).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Culture espianto microdissezionate può essere utilizzato per isolare in modo affidabile e riproducibile popolazioni di cellule che contiene una percentuale molto elevata (~ 85%) di proliferativa Myf-5 positive le cellule staminali del muscolo scheletrico (SMSC). Nelle condizioni cultura rigorosamente controllate qui descritto culture espianto primario può essere utilizzato per caratterizzare i comportamenti di crescita del topo mutante SMSC geneticamente e può essere usato come mezzo per produrre miotubi per dettagliata analisi in vitro dei processi di differenziazione. Accurata manutenzione e la manipolazione di queste culture permette a lungo termine cultura e di espansione. Utilizzando i metodi descritti qui è anche possibile derivare clonale muscolo scheletrico linee di cellule staminali provenienti da culture espianto mediante diluizione singola cellula. Per raggiungere la proliferazione di singole cellule isolate durante la procedura di clonazione, &quot;medium condizionato&quot; viene usato per mimare la condizione normale di queste cellule ad alta densità cultura. Il metodo è applicabile (con modifica) per embrionali, tessuti adulti e anziani, adulti e oltre a mouse può essere utilizzato per isolare le cellule dei muscoli scheletrici di altre specie tra cui umani (Rao e Smith, inedito), embrione di pollo e pesce ( salmone) 24. SMSC clonale derivata può essere analizzato in vivo per via intramuscolare trapianto e in queste condizioni iniettato SMSC si combinano con miotubi host per formare fibre muscolari ibrida. SMSC iniettata per via intramuscolare non si formano i tumori e sono stati trovati nei muscoli ospitare nella posizione delle cellule satellite più di un anno dopo l&#39;iniezione, suggerendo che essi sono soggetti al controllo endogeno da parte delle cellule satelliti di cellule staminali niche.These può essere re-iniettato isolato da ospita come SMSC proliferativa più di 12 mesi dopo l&#39;iniezione ospitare 19.

<table><tbody><tr><td>Miscela 1:1 di DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Mezzo liquido: (Dulbecco&amp;rsquo;s Mezzi di Eagle modificati&amp;rsquo;s medio e Ham&amp;rsquo;s F12 medium, 1:1 v/v</td></tr><tr><td>100&amp;#215; Glutammina (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Diluito nel mezzo a un 1&amp;#215; concentrazione di 2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R)</td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FCS)</td><td>Da un certo numero di aziende diverse</td><td></td><td>Testato su colture primarie e linee cellulari di muscolo scheletrico. Supplemento al 10-20% da aggiungere ai mezzi liquidi</td></tr><tr><td>Heraeus Labofuge 300</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Centrifuga da laboratorio in grado di raggiungere 1.000 giri al minuto</td></tr><tr><td>Tubi da centrifuga Falcon da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Deve essere adatto alla centrifuga del laboratorio</td></tr><tr><td>Plastiche per colture cellulari (contenitori per colture cellulari da 25, 75 o 175 mm²; piastre per colture cellulari a 96 pozzetti; piastre di Petri da 60 mm).</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO umidificato&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubatore (Heraeus)</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Il nostro è rivestito in rame, consigliato per ridurre la contaminazione</td></tr><tr><td>Cappa sterile a flusso laminare (Heraeus)</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Il nostro è un cappe di Classe II &amp;#8211; adatto per l'uso con tessuti umani</td></tr><tr><td>Bagno termico</td><td>Grant Equipment</td><td></td><td>Mantenuto sempre a 37&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo al 70%</td><td></td><td></td><td>Per la sterilizzazione (animali, strumenti per dissezione) e per asciugare banconi, cappe, ecc. </td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato priva di calcio e magnesio (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>PBS testato per colture cellulari (Dulbecco&amp;rsquo;s formula) è acquistato come polvere pronta o in forma di compresse e viene preparato con acqua bidistillata prima della sterilizzazione in autoclave. Il PBS è composto da 2,68 mM di cloruro di potassio (KCl); 1,47 mM di fosfato monobasico di potassio (KH2PO4); 0,137 M di cloruro di sodio (NaCl); e 8,1 mM di fosfato dibasico di sodio (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4). Il PBS può essere preparato ex novo come segue: 200 mg di KCl, 200 mg di KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 8 g di NaCl e 1,15 g di Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/l di acqua bidistillata seguita da sterilizzazione in autoclave.&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Vial CryoTube</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Un emocitometro di Neubauer e coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Per la stima del conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Contatore manuale</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico, Zeiss Stemi 1000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Per la preparazione degli espianti</td></tr><tr><td>Piccola cappa sterile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti sterili per dissezione (inclusi quelli da orafo)&amp;rsquo;s pinze</td><td></td><td></td><td>Sterilizzato in autoclave</td></tr><tr><td>Vasetti di raccolta in plastica sterili (tubi bijou da 7 ml o universali da 20 ml)</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Riscaldare il mezzo PECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Preparato in cappa sterile e riscaldato a 37&amp;#x00B0;C nel bagnomaria per colture cellulari. DMEM:F-12 integrato con 20% di siero fetale bovino (FCS), 1% di glutammina e 1% di penicillina &amp;amp; soluzione di streptomicina</td></tr><tr><td>Dispase (50 &amp;mu;g/ml, equivalente a 6 unità/mg </td><td>Disponibile da MP Biomedicals, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;g/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolo, diidrocloruro (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Per la visualizzazione microscopica dell'apoptosi e della mitosi</td></tr><tr><td>liquido di montaggio fluorescente Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente eretto con filtro ultravioletto (utilizziamo un Nikon Eclipse E600)</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale e software di imaging (utilizziamo una fotocamera Nikon Coolpix 995; una fotocamera Nikon D3)</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software OpenLab4.0a</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adulte e embrionali muscolo scheletrico microexplant cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Colture di cellule embrionali e adulte del muscolo scheletrico hanno un numero di usi differenti. Il micro-dissezionato espianti tecnica descritta in questo capitolo è un metodo robusto e affidabile per isolare un numero relativamente alto di proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Gli autori hanno usato micro-sezionato culture espianto di analizzare le caratteristiche di crescita delle cellule del muscolo scheletrico nei muscoli wild-type e distrofiche. Ognuno dei componenti della crescita dei tessuti, vale a dire la sopravvivenza delle cellule, la proliferazione, senescenza e differenziazione possono essere analizzati separatamente utilizzando i metodi descritti qui. L&#39;effetto netto di tutte le componenti della crescita può essere stabilita per mezzo di misurare i tassi escrescenza espianto. Il micro-espianto metodo può essere utilizzato per stabilire colture primarie da una vasta gamma di tipi di muscoli ed epoche diverse e, come descritto qui, è stato adattato dagli autori per permettere l&#39;isolamento di precursori embrionale del muscolo scheletrico. Unicamente, micro-culture espianto sono stati utilizzati per ricavare clonale (origine singola cellula) delle cellule staminali del muscolo scheletrico (SMSC), linee che possono essere espanse e utilizzate per il trapianto in vivo. SMSC nel vivo trapiantato si comportano come funzionale, tessuto-specifici, le cellule satellite che contribuiscono alla rigenerazione delle fibre muscolari scheletriche, ma che sono anche conservate (nella nicchia delle cellule satellite) come un piccolo pool di cellule staminali indifferenziate che possono essere re-isolato nella cultura utilizzando il micro-espianto metodo.

Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Le cellule di muscolo scheletrico embrionale e adulto in coltura hanno diversi utilizzi. La tecnica di espianti microdissezionati descritta in questo capitolo è una...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare popolazioni arricchite di cellule staminali del muscolo scheletrico da innesti di tessuto microdissecati ottenuti da muscolo adulto o da embrioni, al fine di studiarne il comportamento e la funzione. Queste cellule potrebbero inoltre avere un'utilità terapeutica. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando i muscoli bersaglio da carcasse di topo adulte o da embrioni prelevati dal tessuto uterino in condizioni asettiche.Il secondo passaggio della procedura consiste nel lavare e pulire i tessuti muscolari: per i tessuti muscolari adulti, dissezionare il tessuto adiposo e quello connettivo e trasferirli in mezzo DF 20 fresco; per gli embrioni, rimuovere le membrane esterne e gli organi interni e trasferirli in DF 20 fresco. Successivamente, dissezionare il campione per isolare le regioni ricche di muscolo.Il terzo passaggio della procedura consiste nel microdissécare i tessuti isolati in cubi di 400 micrometri. Trasferire singolarmente gli espianti al centro delle 60 pozzette di una piastra a 96 pozzette e incubare a 37 gradi Celsius. L'ultimo passaggio della procedura è valutare le cellule.Le cellule inizieranno a emergere da espianti x di successo nel giro di poche ore o fino a due settimane dopo l'espianto, a seconda dell'origine del tessuto. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano cellule che iniziano a emergere da espianti X riusciti; queste cellule possono essere espanse e successivamente utilizzate per una serie di scopi diversi in vitro e in vivo, inclusi studi sulla proliferazione e sull'apoptosi e l'identificazione di marcatori proteici. Queste cellule possono inoltre essere derivate clonalmente, modificate geneticamente e infine trapiantate in un ospite per lo studio della rigenerazione o per testare applicazioni terapeutiche.Ciao, sono Janet Smith del mio laboratorio di biologia delle cellule staminali del muscolo scheletrico della School of Biosciences, Università di Birmingham. Sono Dean Lana del laboratorio di Janet Smith e sono Byron Chen, anch'io del laboratorio di Janet Smith. Oggi vi mostreremo un procedimento per ottenere colture di cellule staminali del muscolo scheletrico da frammenti di tessuto muscolare ottenuti mediante microdissezione da muscoli adulti ed embrioni.Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare i comportamenti delle cellule staminali del muscolo scheletrico, come la proliferazione, l'apoptosi e la differenziazione, nonché il malfunzionamento delle cellule staminali muscolari in malattie come la distrofia muscolare. Cominciamo dunque. Il metodo di base per ottenere colture da microespianti di muscolo scheletrico inizia con la dissezione dei muscoli bersaglio da un topo appena sacrificato e mantenuto al freddo, in condizioni asettiche.In questa dimostrazione, i muscoli degli arti posteriori vengono dissecati, lavati isolando i muscoli mediante due cambi di mezzo DF 20 e quindi posizionati in mezzo DF 20 fresco in una piastra da 60 millimetri. Utilizzando un microscopio stereoscopico da dissezione, dissecare accuratamente i muscoli in condizioni sterili per escludere tessuto adiposo, connettivo e osseo. Successivamente, tagliare i pezzi di muscolo puliti in cubi di 400 micrometri usando pinzette da orafo.Posizionare singolarmente i pezzi di muscolo al centro delle 60 pozzette di una piastra a 96 pozzette contenente 50 microlitri di DF 20 ciascuna. Riempire le pozzette perimetrali con soluzione salina per evitare l'essiccamento delle pozzette contenenti l'espianto. Esaminare le pozzette al microscopio e quindi posizionare la piastra a 96 pozzette nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.L'adesione dei microespianti e l'espansione cellulare vengono valutate dopo 24-48 ore di incubazione e successivamente a intervalli di 48-72 ore, a seconda della velocità di crescita dei muscoli coltivati. Qui sono mostrati esempi di espansione al secondo giorno da muscolo scheletrico adulto espiantato e di un'espianto stabilizzato con colture aggregate e alta densità cellulare. Gli espianti vengono valutati in base al livello di confluenza delle cellule in ciascun pozzetto, come verrà illustrato in seguito per l'espansione e l'isolamento delle cellule SMS.La coltura di espansione deve essere monitorata singolarmente per identificare cellule con una morfologia tipica delle cellule SMS, cioè cellule sferiche mononucleate ad alta refrattività che crescono in aggregati clusterizzati. Iniziare questa procedura dissezionando embrioni E 12,5 dall'utero. Embrioni compresi tra lo stadio E 11,5 ed E 17,5 possono essere dissecati allo stesso modo.Posizionare singolarmente gli embrioni in piatti di Petri contenenti PECM, pronti per la microdissezione dettagliata. Gli embrioni singoli vengono quindi ulteriormente dissecati per isolare le aree ricche di muscolo scheletrico. In primo luogo, rimuovere gli organi interni, dissezionare la parte posteriore della coda e gli arti inferiori, nonché le pareti del corpo superiore e inferiore.Posizionare tutti i tessuti dissecati in PECM fresco per rinvigorire l'embrione. Nelle colture di espianti microchirurgici, dissecare microscopivamente gli arti anteriori e posteriori e le pareti del corpo superiore e inferiore per ottenere piccoli cubi di tessuto di dimensioni uguali. Posizionare questi micropianti singolarmente al centro delle 60 pozzette di una piastra a 96 pozzette contenente 50 microlitri di PECM per pozzetta.Deve essere allestita una piastra con almeno 60 pozzetti contenenti una pianta x per pozzetto per ogni embrione studiato, al fine della coltivazione degli embrioni. I 60 pozzetti centrali possono essere suddivisi in regioni che indicano l'origine dell'espianto. Questo schema prevede 15 pozzetti ciascuno, rispettivamente per arto, parete del corpo superiore, arto posteriore e parete del corpo inferiore.Incubare l'espianto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre settimane. Durante l'incubazione di tre settimane, gli espianti vengono valutati al terzo, settimo, quattordicesimo e ventunesimo giorno di coltura utilizzando un microscopio invertito. Gli espianti vengono valutati in base al livello di confluenza delle cellule in ciascun pozzetto.Questo esempio illustra i diversi livelli di confluenza di colture primarie di espianati embrionali E15,5 colorati con myth cinque zero al 14%, 15 al 24%, 25 al 49%, 50 al 74% e 75 al 100%. Immagini fotografiche delle colture possono essere acquisite anche una volta che le colture di espianati X confluenti, che mostrano le caratteristiche morfologiche delle cellule SMS, possono essere sottocoltivate. Rimuovere il mezzo di coltura dalle pozzette selezionate e filtrarlo utilizzando un filtro per siringa in acetato di cellulosa da 0,2 micrometri.Conservare il mezzo per l'uso come mezzo condizionato per ciascuno. Aggiungere 100 microlitri di dischi diluiti uno a 10 in PECM. Quindi reinserire la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Dopo 20 minuti, utilizzare la punta di una pipetta per staccare delicatamente le cellule allentate dalla superficie della pozzetta; quindi centrifugare la sospensione cellulare a 1000 ×g per tre minuti per formare il pellet cellulare. Le cellule vengono diluite per risospensione in due millilitri di PECM e successivamente trasferite nelle pozzette di una nuova piastra a 48 pozzette. Infine, trasferire il mix cellulare in piastre a 48 pozzette per ulteriore espansione.Per preparare le cellule per l'analisi, si effettua un subcultivo su piastra di colture primarie di embrioni Splunk in PECM e mezzo condizionato, seminando le cellule su coverslip in piastre a 48 pozzetti. Le cellule vengono seminate a una densità di tre volte 10 alla tre cellule per centimetro quadrato e incubate a 37 gradi Celsius per consentire l'adesione, che di solito richiede da quattro a sei ore, al fine di valutare apoptosi e proliferazione. Lavare le cellule sui coverslip due volte con PBS e fissarle con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, lavare i coverslip con PBS per 10 minuti, quindi colorarli con 10 microgrammi per millilitro di DPI per tre minuti.Avvolgere la piastra con pellicola e lavare i coverslip una volta in PBS per cinque-dieci minuti. Successivamente, rimuovere il coverslip dal pozzetto e capovolgerlo su una goccia di dacocitazione. Montare il mezzo su un vetrino e sigillare i bordi del coverslip con smalto per unghie per la conservazione.Avvolgere i vetrini nella pellicola di alluminio e conservarli a meno 20 gradi Celsius per il conteggio. I vetrini vengono osservati in fluorescenza al microscopio diritto e analizzati per cellule apoptotiche e mitotiche utilizzando un IP grae. Quando gli explant vengono accuratamente impiantati da muscolo scheletrico adulto o da embrioni, inizieranno a generare cellule entro poche ore fino a 72 ore di incubazione a 37 gradi Celsius.A seconda della loro origine, l'espansione della popolazione cellulare avviene nell'arco di alcuni giorni per innesti embrionali o di alcune settimane per innesti di muscolo scheletrico più maturi, al fine di generare colture primarie dense di cellule SMS aggregate, rappresentative di una derivazione clonale riuscita di una cellula SMS, come mostrato qui. Una singola cellula isolata in una piastra a 96 pozzetti diventa una colonia di origine monoclonale che alla fine dà origine a una popolazione clonale stabilita. L'immunohistochimica per MIF5 viene successivamente utilizzata per verificare l'identità delle cellule SMS.Cellule staminali adulte derivate dal muscolo scheletrico vengono trapiantate nel muscolo tibiale anteriore di topi ospiti e queste cellule sono identificate mediante marcatura con beta GC in questa immagine acquisita a tre mesi dal trattamento; tre cellule recentemente fuse positive per beta-galattosidasi, colorate in blu, sono osservate in una fibra muscolare a 14 mesi dal trattamento e un ampio contributo di cellule positive per beta-galattosidasi nelle fibre muscolari è rilevato mediante anticorpo anti-beta-galattosidasi colorato in marrone. Una cellula satellitare positiva per beta-galattosidasi è indicata dalla freccia in questa immagine. La colorazione è assente nel controllo in cui non è stato utilizzato l'anticorpo primario quando le cellule sono state isolate dai muscoli ospiti trattati a 12 mesi dal trattamento.Le cellule beta galatto positive in coltura proliferante, sottoposte a cariotipizzazione di una linea cellulare clonale murina SMS, rivelano un complemento cromosomico diploide normale. L'espressione beta galatto in una colonia di cellule PD50A è mostrata mediante istochimica. Analisi in vitro di mioblasti embrionali distrofici MIF5 positivi rivelano che questi mioblasti sono iperproliferativi e predisposti all'apoptosi. Come mostrato in questo grafico, la velocità di espansione dei mioblasti embrionali dalla coltura di explant di Muscle X è aumentata sia nei mutanti knockout MDX che CAV3 rispetto all'esplant di tipo selvatico. Un esempio di explant colorato mediante immunomarcatura per MIF5 è mostrato qui. L'iperproliferazione dei mioblasti embrionali è osservata in questi mutanti knockout MDX e CAV3, come determinato dalla positività all'immunoreattività per KI67.Inoltre, un aumento dell'apoptosi si verifica in entrambi questi mutanti, come mostrato dalla colorazione con DPI, e questa immagine mostra un esempio di una cellula apoptotica indicata dalla freccia. Abbiamo appena illustrato come isolare cellule staminali del muscolo scheletrico da adulti ed embrioni mediante microdissezione degli espianti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione alle dimensioni degli espianti microdissezionati.Se sono troppo grandi, causeranno affollamento e le cellule moriranno. Se sono troppo piccole, non forniranno un adeguato supporto. Buona espansione delle cellule.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Isolare le cellule staminali adulte da muscolo-scheletriche tessuti molli in base alla velocità rispetto della cellula di pallone.

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