Name: Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Impara la tecnica DiOLISTIC per etichettare neuroni in sezioni cerebrali di roditori e primati non umani. Questo metodo consente di studiare la morfologia dei dendriti e delle spine con alta risoluzione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Vorremmo ringraziare Michael Feyder e Terrell Holloway per la loro assistenza durante la configurazione iniziale della tecnica e laboratorio del Dr. Fumi Ono s per l&#39;accesso ai loro microscopio confocale. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of Health attraverso il programma intramurale del NIAAA e NINDS.

1. Preparazione DII / Tungsteno Bead Bullets: DII (1-1'-Dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato) proiettili devono essere preparati in anticipo di tagliare fettine di cervello. La procedura richiede circa 2-4 ore a seconda di quanti proiettili sono preparati in una volta. <ol><li> Se a partire da un nuovo lotto di perline di tungsteno, preparare aliquote di 300 mg ciascuna. Aliquote sono preparati con la sospensione 6 grammi di tungsteno in 2 ml di cloruro di metilene. Poi, pipettare 100 l di soluzione tallone in tubi microcentrifuga per la produzione di aliquote di perle da 300 mg di tungsteno aliquote Conservare a temperatura ambiente (Nota: cloruro di metilene evapora con estrema rapidità alcol può essere utilizzato anche ridurre al minimo l'evaporazione).... </li><li> Quando a partire da aliquote di perline, risospendere ciascuna aliquota (300 perle di tungsteno mg) in 300 ml di cloruro di metilene e coprire rapidamente per evitare l'evaporazione. Questa quantità è sufficiente per 3 lotti di proiettili. </li><li> Preparare la soluzione colorante pesando 13,5 mg di lipofile DII colorante e aggiungendo 450 ml di cloruro di metilene (concentrazione finale = 3mg/100μl). </li><li> Rivestire le perline con colorante. Posizionare un vetrino su un pezzo di cera rivestite di carta pesano e pipettare 100 l di perline sul vetrino. Aggiungere 100 ml di soluzione Dii, mescolare accuratamente con puntale, e aria secca fino perle turno grigio chiaro. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per raschiare perline fuori dal vetrino e tagliare le perle in una polvere fine (Nota: utilizzare una nuova lama se facendo più di un colore di proiettili in modo da non contaminare coloranti).. </li><li> Perline raschiare sul peso perline di carta e imbuto in un tubo da 15 ml. Aggiungere 3 ml di acqua e sonicare a bagnomaria per 10-30 minuti a temperatura ambiente (Nota: dadi della polvere e sonicazione vengono applicati per minimizzare la formazione di grumi rivestito di perline che interromperà l'etichettatura sparse dei singoli neuroni).. </li></ol> 2. Preparazione polivinilpirrolidone (PVP) soluzione e tubazioni: per migliorare l'attaccamento tallone per il tubo proiettile (tubi TEZFEL), rivestimento con polivinilpirrolidone (PVP) soluzione. <ol><li> Preparare 10 ml di soluzione di PVP in acqua ad una concentrazione di 10 mg PVP / ml. </li><li> Utilizzare una siringa da 12 ml con adattatore per tubi (tubi flessibili con diametro leggermente più grandi) per passare il PVP soluzione attraverso il tubo proiettile e poi espellerla fuori dall'altra parte. Riutilizzo soluzione per tubi cappotto più proiettile se diversi lotti sono preparati contemporaneamente. Scartare la soluzione PVP dopo l'uso. </li><li> Per aggiungere le perle al tubo proiettile, vortice le perle per produrre una soluzione omogenea e usare la siringa per tirare il tallone soluzione attraverso il tubo in modo che le microsfere sono equamente distribuiti in tutto il tubo. ((Nota:) cercano di minimizzare il numero di bolle d'aria nel tubo). </li><li> Far passare il tubo attraverso la stazione di preparazione e permettono di risolvere le perline. Usare la siringa per rimuovere delicatamente l'acqua in modo che solo le perline rimangono. </li><li> Spin il tubo nella stazione di preparazione e asciugare con azoto fino gocce d'acqua non sono più visibili. Questa fase dura circa 10-20 minuti. </li><li> Tagliare proiettili con taglierina tubi in 13 mm di lunghezza e il luogo in fiale di scintillazione contenenti Drierite o un qualche tipo di solfato di calcio anidro. Avvolgere in un foglio di fiale al riparo dalla luce. </li></ol> 3. Colorazione Dii: questa tecnica l'etichettatura può essere usata per colorare i neuroni nel tessuto cerebrale da specie diverse, in questo caso particolare, da topo (3-6 mesi) e primati non umani (9-15 anni). E 'preferibile che le fette sono preparati dal tessuto cerebrale fisso ottenuto dalla perfusione transcardiac di soluzione fissativo perché la conservazione dei tessuti dovrebbe essere migliore in questa condizione. Tuttavia, la fissazione per perfusione non è sempre possibile (come è avvenuto con il tessuto scimmia) ed etichettatura DiOLISTIC può ancora essere applicata con successo in diverse procedure di preparazione dei tessuti. Qui si descrivono tre diverse procedure per la preparazione dei tessuti: <ol class="lalpha"><li> Fix per perfusione cerebrale transcardiac → rimuovere cervello → postfix per 10 min → fetta tagliata → macchia </li><li> Rimuovere cervello → blocco taglio del tessuto → blocco fissare → lavare in PBS → fetta tagliata → macchia </li><li> Togliere le fette tagliate cervello → → → fissare lavare → macchia </li></ol> Nel presente studio, i cervelli di scimmia sono stati ottenuti da soggetti che sono stati transcardially perfusi con ghiaccio freddo artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) prima del raccolto del cervello e un blocco (4 mm di spessore) di tessuto che contiene il caudato uno° putamen è stata fissata per 60 minuti a temperatura ambiente. Per tutte le procedure, la soluzione fissativa contiene paraformaldeide 4% e il 4% di saccarosio in PBS (preparato fresco o usato entro 15 giorni). E 'importante notare che i tempi di fissazione sono fondamentali per la colorazione di successo. Overfixation può influenzare colorazione interrompendo l'integrità della membrana plasmatica e causando tintura a fuoriuscire dalla cellula (ulteriori informazioni in risultati). <ol><li> Per la procedura a e b, fette (200μm) sono tagliati dal cervello fisso o il blocco dei tessuti e fette collocati in 24 pozzetti con PBS. Per la procedura c, fresche fette cerebrale acuta (200 micron) vengono tagliati con un vibratome taglio a freddo in soluzione contenente (in mm) 110 colina-Cl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2.5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 di glucosio, 11,6 acido ascorbico, acido piruvico 3,1 (osmolarità mOsmols = 310) e subito dopo fette sono posti in piastre da 24 pozzetti e fissato per 30 minuti con la soluzione fissativa a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le fette con PBS, 3 volte. </li><li> Prima di fette di tiro, togliere il PBS dai pozzi e, utilizzando un pennello, mettere la fetta al centro del pozzo. </li><li> Spara proiettili DII tramite carta 3,0 micron filtro con un sistema Helios Gun Gene a 120-180 psi di pressione del gas elio mettendo la pistola ad una distanza di 1,5 cm tra il campione e la fine della canna. (Nota importante:. Soltanto in neuroni nel raggio di 50 mm della superficie fetta saranno etichettati con questo metodo per cui è importante mantenere la stessa parte della fetta rivolto verso l'alto durante il lavaggio e per il montaggio in questo modo, si farà in modo che il neuroni marcati saranno a breve distanza focale quando l'imaging con un microscopio confocale). </li><li> Lavare le fette di 3 volte con PBS e memorizzarli in PBS per diverse ore per consentire al DII a diffondersi lungo i dendriti. </li><li> Montare le fette su un vetrino con Prolungare Antifade oro e coprire con un coprioggetto 18x18 millimetri No.1. (Nota: per c procedura, è meglio montare fette il giorno stesso l'integrità delle fette non è ben tenuto durante la notte). </li><li> Sigillare con smalto trasparente dopo il montaggio dei media si è asciugato. </li><li> In alternativa, le fette possono essere colorati con gli anticorpi prima di montare come descritto di seguito. (Nota: Le diapositive possono essere utilizzate da almeno 6 mesi a un anno se conservata al buio a 4 ° C. DII è leggero e sensibile esposizione a lungo termine alla luce provoca la macchia a svanire). </li></ol> 4. Colorazione anticorpale: immunocolorazione deve essere eseguita dopo passo 3.4 e prima del montaggio. <ol><li> Permeabilizzazione: fette Incubare a 0,01% Triton X-100 in soluzione PBS per 15 minuti a temperatura ambiente (300-500 microlitri per pozzetto). NOTA: non utilizzare concentrazioni più elevate di detersivo come questa si dissolverà DII e ridurre significativamente la colorazione fluorescente. Cercare di minimizzare il tempo di detergente come incubazioni ampia ridurrà anche l'etichettatura DII. Se incubazioni estesi sono necessari, tenere le fette in PBS, piuttosto che a bloccare soluzione. </li><li> Blocco: fette Incubare a bloccare soluzione contenente siero di capra 10%, 0,01% Triton X-100 in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Anticorpo primario: Aggiungi anticorpo alla diluizione desiderata nella soluzione bloccante (coniglio ad esempio anticorpi anti-GFP in diluizione 1:1000). Aggiungere 300-500 microlitri per pozzetto e incubare per 1-2 ore. (Nota: se durante la notte sono incubazione necessario, togliere dal blocco soluzione detergente). </li><li> Lavare le fette con PBS per 5 - 15 min, 3 volte. </li><li> Anticorpo secondario: Incubare con anticorpo secondario per 30 minuti a temperatura ambiente. Preparare la soluzione secondaria di anticorpi alla diluizione desiderata nella soluzione bloccante (per esempio Alexa Fluor 488-coniugato a diluizione 1:1000). </li><li> Lavare le fette con PBS per 5-15 minuti, 4 volte. </li><li> Monte fette su vetrini con Prolungare Antifade oro e coprire con un coprioggetto 18x18 millimetri No.1. Sigillare con smalto dopo il montaggio dei media si è asciugato. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Verifica della corretta etichettatura: sezione possono essere visualizzate in un ambito di applicazione fluorescente dissezione dotato di una lampada al mercurio e rosso fluorescente cubo filtro per confermare il successo di etichettatura DiOLISTIC. La figura 1 mostra le immagini di sezioni del cervello esemplare ben marcato ottenuto a basso ingrandimento. Due caratteristiche importanti per cercare un modello di etichettatura sono sparse (Figura 1A) e la capacità di identificare i singoli componenti cellulari (Figura 1B-C). </li> L'etichettatura dei problemi DiOLISTIC: La figura 2 mostra esempi di sezioni in cui l'etichettatura DiOLISTIC lavorato in modo errato. Nella nostra esperienza, ci sono tre cause principali per l'etichettatura inefficiente: <ul><li> Etichettatura è troppo rada o fitta: le cellule Pochissimi sono etichettati per sezione, in un caso o troppe cellule sono etichettati prevenire l'isolamento e lo studio dei singoli elementi cellulari. Soluzione: regolare la concentrazione di perline rivestito nella soluzione finale utilizzato per il rivestimento dei tubi proiettile TEFZEL (sezione 1.6). Diminuire o aumentare il volume di acqua (3 ml valore iniziale) utilizzato per sciogliere le perle al fine di correggere per l'etichettatura di troppo scarsa o troppo denso, rispettivamente. Inoltre, bassa efficienza di etichettatura potrebbe essere causato da meno di pressione del gas ottimale durante le riprese le perline rivestiti sulla sezioni. Questa possibilità può essere esclusa facendo in modo che il tubo proiettile TEFZEL ha rilasciato la maggior parte delle perle rivestito e appare chiaro dopo lo scatto. In caso contrario, la pressione del gas per le riprese dovrebbero essere aumentati. </li><li> Proiettili Bad: zolle di grandi dimensioni o gruppi di materie coloranti tungsteno rivestiti perle si formano durante la preparazione proiettile. Sezioni somiglierà esempi della Figura 2A-B. Soluzione: fare proiettili nuovo con particolare attenzione al punto 1.5 e / o estendere il tempo di sonicazione nella sezione 1.6. </li><li> Over-fissazione: il tessuto è mantenuto in soluzione paraformaldeide più a lungo del tempo in modo ottimale per il fissaggio (30 minuti di 200-300 micron sezioni, 1 ora per 4 sezioni mm). Questo compromette l'integrità della membrana plasmatica e produce sezioni etichettate che assomigliano a quelli mostrati nella figura 2C-D in cui l'etichettatura sembra fuori fuoco a causa della dispersione di colorante fuori delle cellule. Soluzione: ridurre i tempi di fissazione. </li></ul><li> Confocale: pile immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale (Zeiss LSM 510 META) con un obiettivo 20x per tutta la cella e 63x obiettivo immersione in acqua per i segmenti di dendriti. Dii era eccitato con un DPS linea laser 561 nm e fluorescenza verde dal anticorpo secondario è stato eccitato con una linea di laser a 488 nm. Il sezionamento ottico del campione etichettato ottiene quando usando la microscopia confocale consente inoltre per l'isolamento di singole cellule marcate nel campione. Figura 3A mostra un striato neurone spinoso medio dal cervello di topo e il suo complesso disegno ramo dendrite. Immagini ad alto ingrandimento di rami dendrite di questi neuroni di roditori (Figura 3B) e primate non umano (Figura 3C) dimostrano il grado di colorazione in dendriti e spine dendritiche usando questa tecnica in entrambe le specie. Dendriti e le loro sporgenze (spine) appaiono ben definite, anche quando si considera la lunga e sottile colonna vertebrale teste così abbondante nei neuroni spinosi di media. Quando si combinano con DiOLISTICS immunostaining, l'imaging confocale è utile anche per localizzare in modo inequivocabile la macchia allo stesso piano focale e la stessa cella. Figura 4 mostra un esempio di colocalizzazione di DII etichettatura e immunocolorazione per GFP in una singola cella. L'immagine è una pila (0,7 micron z-sezione) ottenuto da una fetta striato da un topo transgenico che esprime la proteina fluorescente GFP sotto il promotore del recettore della dopamina D1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dii etichettatura dei neuroni in fettine di cervello di primati non umani. (A) a basso ingrandimento immagine di una fetta cervello colorato che contiene il nucleo caudato da una scimmia cynomolgus che mostra l'etichettatura sparse di neuroni con DII. (BC) Isolati neuroni spinosi medi possono essere facilmente identificati utilizzando un ambito fluorescente dissezione. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risoluzione dei problemi di etichettatura DiOLISTIC. (AB) fette colorato da striato dorsale della scimmia (A) e mouse (B), che mostra grandi ciuffi di colorante rivestite perline e, di conseguenza, non i singoli elementi cellulari possono essere distinti. (CD) Le immagini che esemplificano il risultato dell'applicazione DiOLISTIC l'etichettatura di sezioni che sono stati tenuti in soluzione fissante per periodi prolungati di tempo o in cui la conservazione dei tessuti fallito scimmia (C) e mouse (D) dei tessuti. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagine confocale di neuroni spinosi striatali medio macchiata di DII. (A), serie di immagini di una cellula intera permette di analisi morfologica dei rami dendritici. (BC) segmenti Dendrite da mouse (B) e scimmie (C) neuroni spinosi di media mostrano una chiara etichettatura dei dendriti e spine. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Combinando l'etichettatura DiOLISTIC con immunocolorazione. (A) DII etichettati (B) immunocolorazione con l'utilizzo di anticorpi anti-GFP come descritto da metodi adattato da Lee et al. (2006). Stesso campo A. (C) immagine composita di rosso e di fluorescenza verde identifica DII-etichettato come un neurone GFP-positive neurone.

<ol><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%22DiOLISTIC%22+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li>
<li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li>
<li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li>
<li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li>
<li>Neely, S. tanwood, Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diolistics%3A+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li>
<li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li>
</ol>

Tutte le procedure di animali sono state eseguite seguendo la guida dalla cura degli animali e del Comitato uso in NIAAA e la Nazionale dell&#39;Oregon Primate Research Center. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Etichettatura DiOLISTIC è una delle tecniche più versatili disponibili per le cellule fluorescenti etichettatura perché può essere applicato a sezioni di tessuto da specie diverse, ad una vasta gamma di età, e di tessuti ottenuti fresche o da fissativo-perfuso animali (vedi anche Gan et al ., 2009). Il processo è relativamente veloce come ci vogliono 1-2 giorni e può essere combinato con altri approcci un&#39;etichettatura più classici come immunocolorazione (Lee et al., 2006). Particolare attenzione deve essere prestata per evitare un eccesso di fissaggio e l&#39;uso di alte concentrazioni di detergenti in soluzioni di incubazione perché questi comprenderà l&#39;integrità delle membrane lipofile e causare il colorante a trapelare delle cellule. Penetrazione anticorpo può essere facilitata da basse concentrazioni di Triton X-100 (Lee et al., 2006), così come digitonina saponina o nella soluzione di incubazione (Matsubayashi et al., 2008). Alcune modifiche che possono essere applicati a questa tecnica includono l&#39;uso di proiettili con coloranti diversi come descritto da Gan et al. (2000) o cambiare la lunghezza e il tipo di esposizione anticorpi (Neely et al., 2009). Tradizionalmente, DII è stato utilizzato per tracciare le proiezioni dei neuroni nel cervello. Etichettatura DiOLISTIC espande la sua applicazione con la descrizione di un metodo utile per esaminare la morfologia cellulare. Morfologia neuronale è di grande interesse a causa della grande diversità trovano nel cervello e la speculazione che la forma delle cellule potrebbe riflettere sulla molteplicità funzione delle popolazioni neuronali del sistema nervoso. Un esempio di questo è il fatto che molti neuroni in sporgenza display del sistema nervoso dei mammiferi di piccole chiamato spine dendritiche, che sono il sito di sinapsi glutammatergica. In questo modo, la densità di sinapsi glutammatergica su una cella può essere correlata alla densità delle spine dendritiche, che può essere misurato utilizzando la tecnica di etichettatura qui descritti. Inoltre, altri parametri morfologici come dendrite lunghezza totale, modello di ramificazione, la forma della colonna vertebrale dendritica e la densità può essere quantificata e studiata. L&#39;uso di etichette fluorescenti per lo studio della morfologia neuronale ha molti vantaggi rispetto alle tecniche più tradizionali che si basano sulla microscopia in campo chiaro (es. colorazione di Golgi) perché permette di avere immagini ad alta risoluzione confocale. Un altro vantaggio di usare DII come fluoroforo in esperimenti volti a misurare la densità dendritica e la morfologia della colonna vertebrale è la sua proprietà lipofile. Partizioni Dii nella membrana plasmatica e fornisce un profilo ben definito dei processi neuronali e sporgenze dendritiche. Dato il piccolo volume della maggior parte delle spine dendritiche (meno di 1 femtoliter), marcatura di membrana più efficiente e permette una migliore visualizzazione di piccole, sottili protrusioni di colorazione citoplasmatica.

<table><tbody><tr><td>1-1&amp;rsquo;-dioctadecil-3,3,3&amp;rsquo;,3&amp;rsquo;-tetrametil-indocarbocianina perclorato (DiI)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di metilene</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>H485-06</td><td></td></tr><tr><td>Perline di tungsteno</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2269</td><td>1,7 &amp;#x03BC;m di diametro</td></tr><tr><td>Polyvinylpirrolidone</td><td>Calbiochem</td><td>529504</td><td></td></tr><tr><td>Tubatura in Tefzel</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>Taglierino per tubi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>Helios Gene Gun</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2431</td><td></td></tr><tr><td>Carta filtrante in membrana Isopore</td><td>EMD Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>dimensione dei pori 3,0 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>(16% p/v)</td></tr></tbody></table>

etichettatura diolistic di neuroni da roditori e non-umano fette cervello dei primati

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Colorazione DiOLISTIC usa la pistola del gene per introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni di fette di cervello (Gan et al, 2009;. O&#39;Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Qui fornire una descrizione dettagliata di ogni passo necessario insieme con le immagini esemplare di risultati buoni e cattivi che aiuteranno durante l&#39;impostazione della tecnica. Nella nostra esperienza, a pochi passi dimostrato fondamentale per la corretta applicazione delle DiOLISTICS. Queste considerazioni sono la qualità del DII rivestite proiettili, il grado di esposizione fissativo, e la concentrazione di detersivo utilizzato nelle soluzioni di incubazione. Suggerimenti e soluzioni per i problemi più comuni sono forniti. Questa è una tecnica di etichettatura versatile che può essere applicato a specie animali più a una vasta gamma di età. A differenza delle altre tecniche di marcatura fluorescente che sono limitati alle preparazioni di animali giovani o ristrette per topi perché si basano su l&#39;espressione di un transgene fluorescente, l&#39;etichettatura DiOLISTIC può essere applicato ad animali di ogni età, specie e genotipi e può essere utilizzato in combinazione con immunocolorazione per identificare una sottopopolazione di cellule. Qui mostriamo l&#39;utilizzo di DiOLISTICS ai neuroni etichetta in fettine di cervello di topi adulti e adulti primati non umani con lo scopo di quantificare dendrite ramificazione dendritica e la morfologia della colonna vertebrale.

Dimostriamo l&#39;uso della pistola gene di introdurre coloranti fluorescenti, come Dii, in neuroni in fettine di cervello di roditori e primati non umani di età diverse. In questo caso particolare, noi usiamo topi adulti (3-6 mesi) e adulti scimmie cynomologus (9-15 anni). Questa tecnica, originariamente descritta dal laboratorio del Dr. Lichtman (Gan<em&gt; Et al</em&gt;., 2000), è particolarmente adatto per lo studio delle ramificazioni dendritiche e morfologia spine dendritiche e può essere combinato con immunostaining tradizionale, se detergenti sono tenute ad una bassa concentrazione.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

La colorazione DiOLISTIC utilizza il gene gun per introdurre coloranti fluorescenti, come il DiI, nei neuroni di sezioni cerebrali (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Il mio nome è Gail Siebel e sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio della dottoressa Veronica Alvarez presso l'Istituto Nazionale sull'Abuso di Alcol e l'Alcolismo. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con il dottor Kathleen Grant e Andrew Wow presso il Centro sulle Scimmie dell'Oregon e con il dottor James Dene della Wake Forest University, che hanno fornito il tessuto di primati non umani utilizzato in questo studio. L'obiettivo principale di questa procedura è introdurre coloranti fluorescenti nei neuroni ed etichettare sezioni cerebrali provenienti da diverse specie, come roditori e primati di qualsiasi età.Per lo studio della morfologia dei dendriti e delle spine dendritiche, si procede innanzitutto rivestendo i Ts e le perle con un colorante lipofilico come D eye. Il secondo passaggio della procedura consiste nel rivestire i tubicini con perle rivestite con D eye e tagliarli in piccoli pezzi che fungono da proiettili per il sistema del gene gun Helios. Il terzo passaggio prevede di sparare le perle rivestite con D eye all'interno di fette di tessuto cerebrale utilizzando il gene gun.L'ultimo passaggio della procedura è facoltativo, poiché la stilistica può essere combinata con la colorazione immunoistochimica per localizzare contemporaneamente altri marcatori. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un'etichettatura fluorescente scarsa di neuroni, adatta a immagini ad alta risoluzione, come la microscopia confocale o a due fotoni, e allo studio della ramificazione dendritica e della morfologia delle spine dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti è che la stilistica può essere applicata a sezioni cerebrali di animali di tutte le specie, età e genotipi.È possibile utilizzarlo in combinazione con l'immunomarcatura, producendo un'etichettatura fluorescente sparsa adatta alla microscopia ad alta risoluzione. Prima di preparare i proiettili, ricoprire le perle di tungsteno con un colorante lipofilo in una cappa chimica, utilizzando 450 millilitri di cloruro di metilene e 13,5 milligrammi di colorante lipofilo (DiI) per una concentrazione finale di 30 milligrammi per millilitro. Prendere un tubo pre-Eloqua contenente 300 milligrammi di perle di tungsteno e aggiungere 300 microlitri di cloruro di metilene; agitare vigorosamente per risospendere le perle e ottenere una soluzione omogenea.Si utilizzano soltanto 100 milligrammi di perline di tungsteno per set di proiettili, pipettando su e gi&ugrave; per mantenere le perline sospese; aggiungere 100 millilitri di perline e il colorante disciolto su un vetrino di vetro e mescolare accuratamente. Con la punta di una pipetta, lasciare asciugare completamente fino a quando le perline diventano grigio chiaro. Posizionare un pezzo pulito di carta da forno sotto il vetrino utilizzando una lama pulita; per ogni colore di proiettili, raschiare le perline dal vetrino e macinarle in una polvere fine.Scrapare le perle rivestite sulla carta da forno e convogliarle in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di acqua e sottoporre a sonificazione nel bagno a ultrasuoni per 10-30 minuti a temperatura ambiente, al fine di disperdere completamente eventuali aggregati. Tagliare 0,7 metri di tubo verde acqua con un'estremità inclinata e collegare l'altra estremità a una siringa da 12 millilitri mediante un adattatore per tubo; immergere l'estremità libera in un tubo contenente 10 millilitri di una soluzione di polivinilpirrolidone (PVP) al 10 milligrammi per millilitro e aspirare completamente la soluzione attraverso il tubo fino a riempire la siringa.Vortexare la soluzione delle perle mentre si pompa con la siringa per ottenere una miscela omogenea, lavorando rapidamente per evitare la precipitazione delle perle; aspirare completamente la soluzione nel tubo. Evitare di introdurre bolle d'aria, che impedirebbero l'adesione delle perle al tubo in quel punto, mantenendo il tubo teso da entrambe le estremità. Inclinarlo da un lato all'altro in modo uniforme.Distribuire le perle. Inserire il tubo nella stazione di preparazione e lasciare sedimentare le perle per 30-60 secondi. Utilizzare la siringa in modo lento ma costante.Rimuovere l'acqua lasciando indietro le perle. Scollegare immediatamente la siringa e iniziare a far ruotare il tubo. Regolare il flusso di azoto sulla stazione di preparazione a quattro-cinque LPM secchi per 10-20 minuti, fino a quando non si vedono più goccioline d'acqua.Rimuovere il tubo dalla stazione di preparazione, tagliare i proiettili in lunghezze di 13 millimetri utilizzando il tagliatubi; sui proiettili buoni si osserverà una leggera patina grigia che ricopre uniformemente l'interno. Posizionare i proiettili in vial per scintillazione avvolti nella carta stagnola e contenenti un agente disidratante, come solfato di calcio anidro. Conservarli a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.La marcatura con DiI può essere utilizzata per colorare i neuroni in tessuti cerebrali di diverse specie ed età, conservati mediante vari metodi. Posizionare le sezioni di cervello, fissate sia prima che dopo il taglio, nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.Lavare le sezioni in PBS S3 per tre volte, da cinque a dieci minuti per ogni lavaggio. Aspirare il PBS e utilizzare un pennello per centrare la sezione nella pozzetta. Posizionare un pezzo di filtro da 3,0 micrometri tra le due schermature metalliche di diffusione all'estremità del rivestimento della canna della pistola genica.Tenere la pistola genica in modo che l'estremità del rivestimento della canna sia a 1,5 centimetri dal campione. Sparare le perle nella sezione con una pressione di gas elio compresa tra 120 e 180 PSI. Lavare rapidamente le sezioni tre volte con un XPBS per rimuovere il colorante in eccesso.Assicurarsi che la superficie del taglio del campione rimanga rivolta verso l'alto durante tutte le operazioni di manipolazione dei liquidi. Conservare i campioni in PBS per tre-sei ore per permettere al DAI di diffondersi lungo le dendriti, coprendo con carta stagnola. Poiché il DAI è sensibile alla luce, i campioni possono essere montati a questo stadio o sottoposti a ulteriore colorazione con anticorpi, come descritto nella sezione successiva, per proseguire con la colorazione utilizzando da 300 a 500 microlitri di soluzione di permeabilizzazione contenente 0,01% TRITTON X 100 in un XPBS per ogni campione, incubando a temperatura ambiente esattamente per 15 minuti.Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione dalle pozzette; bloccare le sezioni in una soluzione contenente siero di capra al 10% e Triton X-100 allo 0,01% in PBS 1X, quindi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere da 300 a 500 microlitri di anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco a ciascuna pozzetta; incubare a temperatura ambiente per una-due ore oppure tutta la notte, a seconda dell'anticorpo. Lavare le sezioni tre volte con PBS 1X, per cinque-quindici minuti per ogni lavaggio; rimuovere la soluzione dalla pozzetta.Aggiungere da 300 a 500 microlitri di anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco a ciascun pozzetto. Lavare quattro volte con 1x PBS per cinque-quindici minuti per ogni lavaggio, come in precedenza; montare le sezioni su un vetrino con un mezzo di montaggio fluorescente e coprire con un coverslip da 18 × 18 millimetri. Lasciare asciugare per sei-dodici ore a temperatura ambiente prima di sigillare i bordi con smalto trasparente, quindi conservare al buio o coperto a quattro gradi Celsius.Qui sono mostrate immagini esemplificative di sezioni cerebrali marcate. Due caratteristiche importanti da ricercare sono un pattern di marcatura scarso a bassa ingrandimento e la capacità di identificare singoli componenti cellulari. Una preparazione errata dei proiettili o una fissazione eccessiva del tessuto possono portare a una marcatura scadente, come mostrato qui.Sono forniti suggerimenti per la risoluzione dei problemi nel testo. &Egrave; presente un'immagine confocale di un neurone spinoso medio del TAL proveniente dal cervello di topo e del suo complesso modello di ramificazione dendritica. La sezione ottica ottenuta mediante microscopia confocale consente l'isolamento di singole cellule marcate nella sezione di tessuto.Le immagini ad alto ingrandimento mostrano segmenti di dendriti provenienti dal cervello di un roditore e da quello di una scimmia non umana. Si noti l'elevata intensità della colorazione fluorescente ottenuta con questa tecnica, che consente di visualizzare chiaramente le spine dendritiche quando si combina la ICS con la colorazione immunoistochimica. Questa immagine mostra un esempio di colocalizzazione dell'etichettatura D eye in rosso con la colorazione immunoistochimica per l'espressione di GFP in verde.Questa immagine corrisponde a una sezione di sal del cervello di un topo transgenico che esprime la proteina fluorescente GFP sotto il promotore del recettore della dopamina D1. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i proiettili e utilizzare la pistola Jing per marcare in modo sparso i neuroni con coloranti fluorescenti. Questa tecnica permette una chiara visualizzazione della morfologia neuronale e lo studio della ramificazione dendritica e delle spine.

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questa relazione dimostra una tecnica per isolamento meccanico di singoli neuroni vitali mantenendo attaccato boutons presinaptica. Vibrodissociated neuroni hanno il vantaggio di una produzione rapida, eccellente controllo farmacologico e migliorato lo spazio-clamp senza influenza dalle cellule vicine. Questo metodo può essere utilizzato per l'imaging di elementi sinaptica e di patch-clamp registrazione.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Questo video dimostra un metodo per isolare neuroni marcati in fluorescenza dal cervello di un topo.

Isolamento di neuroni marcati in fluorescenza da un cervello murino

Il video descrive la registrazione elettrofisiologica delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo. Le fette contenenti il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) vengono poste in una camera di registrazione. Una pipetta stimolante è posizionata sul tratto ottico per stimolare le cellule gangliari retiniche (RGC) e studiare le sinapsi retinogenicolate o il nucleo reticolare talamo per stimolare i neuroni corticali e studiare le sinapsi corticogenicolate.

Uno studio elettrofisiologico delle sinapsi retinogenicolate e corticogenicolate in fette di cervello di topo

Questo video mostra la procedura per colorare fette fisse di cervello di ratto contenenti interneuroni pieni di biocitina. Il protocollo include l'incubazione con il complesso avidina-biotina (ABC), la colorazione con HRP e substrato cromogenico, la conservazione delle strutture con tetrossido di osmio e l'inclusione del tessuto nella resina per l'imaging.

Marcatura di interneuroni riempiti di biocitina in fette di ippocampo di ratto per la visualizzazione

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.

Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

Qui, forniamo un semplice, a basso costo, e in tempi rapidi protocollo fissiamo chimicamente tessuto cerebrale dei primati con acroleina fissativo, consentendo per la conservazione a lungo termine che è compatibile con pre-embedding immunoistochimica per microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Vi presentiamo un protocollo per etichettare e analizzare i neuroni piramidali, che è fondamentale per valutare potenziali alterazioni morfologiche nei neuroni e nelle spine dendritiche che possono essere alla base di anomalie neurochimiche e comportamentali.

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

Impara la tecnica DiOLISTIC per etichettare neuroni in sezioni cerebrali di roditori e primati non umani. Questo metodo consente di studiare la morfologia dei dendriti e delle spine con alta risoluzione.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

Esplora altri video