Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

Il mio nome è Gail Siebel e sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio della dottoressa Veronica Alvarez presso l'Istituto Nazionale sull'Abuso di Alcol e l'Alcolismo. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con il dottor Kathleen Grant e Andrew Wow presso il Centro sulle Scimmie dell'Oregon e con il dottor James Dene della Wake Forest University, che hanno fornito il tessuto di primati non umani utilizzato in questo studio. L'obiettivo principale di questa procedura è introdurre coloranti fluorescenti nei neuroni ed etichettare sezioni cerebrali provenienti da diverse specie, come roditori e primati di qualsiasi età.

Per lo studio della morfologia dei dendriti e delle spine dendritiche, si procede innanzitutto rivestendo i Ts e le perle con un colorante lipofilico come D eye. Il secondo passaggio della procedura consiste nel rivestire i tubicini con perle rivestite con D eye e tagliarli in piccoli pezzi che fungono da proiettili per il sistema del gene gun Helios. Il terzo passaggio prevede di sparare le perle rivestite con D eye all'interno di fette di tessuto cerebrale utilizzando il gene gun.

L'ultimo passaggio della procedura è facoltativo, poiché la stilistica può essere combinata con la colorazione immunoistochimica per localizzare contemporaneamente altri marcatori. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un'etichettatura fluorescente scarsa di neuroni, adatta a immagini ad alta risoluzione, come la microscopia confocale o a due fotoni, e allo studio della ramificazione dendritica e della morfologia delle spine dendritiche. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti è che la stilistica può essere applicata a sezioni cerebrali di animali di tutte le specie, età e genotipi.

È possibile utilizzarlo in combinazione con l'immunomarcatura, producendo un'etichettatura fluorescente sparsa adatta alla microscopia ad alta risoluzione. Prima di preparare i proiettili, ricoprire le perle di tungsteno con un colorante lipofilo in una cappa chimica, utilizzando 450 millilitri di cloruro di metilene e 13,5 milligrammi di colorante lipofilo (DiI) per una concentrazione finale di 30 milligrammi per millilitro. Prendere un tubo pre-Eloqua contenente 300 milligrammi di perle di tungsteno e aggiungere 300 microlitri di cloruro di metilene; agitare vigorosamente per risospendere le perle e ottenere una soluzione omogenea.

Si utilizzano soltanto 100 milligrammi di perline di tungsteno per set di proiettili, pipettando su e giù per mantenere le perline sospese; aggiungere 100 millilitri di perline e il colorante disciolto su un vetrino di vetro e mescolare accuratamente. Con la punta di una pipetta, lasciare asciugare completamente fino a quando le perline diventano grigio chiaro. Posizionare un pezzo pulito di carta da forno sotto il vetrino utilizzando una lama pulita; per ogni colore di proiettili, raschiare le perline dal vetrino e macinarle in una polvere fine.

Scrapare le perle rivestite sulla carta da forno e convogliarle in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di acqua e sottoporre a sonificazione nel bagno a ultrasuoni per 10-30 minuti a temperatura ambiente, al fine di disperdere completamente eventuali aggregati. Tagliare 0,7 metri di tubo verde acqua con un'estremità inclinata e collegare l'altra estremità a una siringa da 12 millilitri mediante un adattatore per tubo; immergere l'estremità libera in un tubo contenente 10 millilitri di una soluzione di polivinilpirrolidone (PVP) al 10 milligrammi per millilitro e aspirare completamente la soluzione attraverso il tubo fino a riempire la siringa.

Vortexare la soluzione delle perle mentre si pompa con la siringa per ottenere una miscela omogenea, lavorando rapidamente per evitare la precipitazione delle perle; aspirare completamente la soluzione nel tubo. Evitare di introdurre bolle d'aria, che impedirebbero l'adesione delle perle al tubo in quel punto, mantenendo il tubo teso da entrambe le estremità. Inclinarlo da un lato all'altro in modo uniforme.

Distribuire le perle. Inserire il tubo nella stazione di preparazione e lasciare sedimentare le perle per 30-60 secondi. Utilizzare la siringa in modo lento ma costante.

Rimuovere l'acqua lasciando indietro le perle. Scollegare immediatamente la siringa e iniziare a far ruotare il tubo. Regolare il flusso di azoto sulla stazione di preparazione a quattro-cinque LPM secchi per 10-20 minuti, fino a quando non si vedono più goccioline d'acqua.

Rimuovere il tubo dalla stazione di preparazione, tagliare i proiettili in lunghezze di 13 millimetri utilizzando il tagliatubi; sui proiettili buoni si osserverà una leggera patina grigia che ricopre uniformemente l'interno. Posizionare i proiettili in vial per scintillazione avvolti nella carta stagnola e contenenti un agente disidratante, come solfato di calcio anidro. Conservarli a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.

La marcatura con DiI può essere utilizzata per colorare i neuroni in tessuti cerebrali di diverse specie ed età, conservati mediante vari metodi. Posizionare le sezioni di cervello, fissate sia prima che dopo il taglio, nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.

Lavare le sezioni in PBS S3 per tre volte, da cinque a dieci minuti per ogni lavaggio. Aspirare il PBS e utilizzare un pennello per centrare la sezione nella pozzetta. Posizionare un pezzo di filtro da 3,0 micrometri tra le due schermature metalliche di diffusione all'estremità del rivestimento della canna della pistola genica.

Tenere la pistola genica in modo che l'estremità del rivestimento della canna sia a 1,5 centimetri dal campione. Sparare le perle nella sezione con una pressione di gas elio compresa tra 120 e 180 PSI. Lavare rapidamente le sezioni tre volte con un XPBS per rimuovere il colorante in eccesso.

Assicurarsi che la superficie del taglio del campione rimanga rivolta verso l'alto durante tutte le operazioni di manipolazione dei liquidi. Conservare i campioni in PBS per tre-sei ore per permettere al DAI di diffondersi lungo le dendriti, coprendo con carta stagnola. Poiché il DAI è sensibile alla luce, i campioni possono essere montati a questo stadio o sottoposti a ulteriore colorazione con anticorpi, come descritto nella sezione successiva, per proseguire con la colorazione utilizzando da 300 a 500 microlitri di soluzione di permeabilizzazione contenente 0,01% TRITTON X 100 in un XPBS per ogni campione, incubando a temperatura ambiente esattamente per 15 minuti.

Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione dalle pozzette; bloccare le sezioni in una soluzione contenente siero di capra al 10% e Triton X-100 allo 0,01% in PBS 1X, quindi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere da 300 a 500 microlitri di anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco a ciascuna pozzetta; incubare a temperatura ambiente per una-due ore oppure tutta la notte, a seconda dell'anticorpo. Lavare le sezioni tre volte con PBS 1X, per cinque-quindici minuti per ogni lavaggio; rimuovere la soluzione dalla pozzetta.

Aggiungere da 300 a 500 microlitri di anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco a ciascun pozzetto. Lavare quattro volte con 1x PBS per cinque-quindici minuti per ogni lavaggio, come in precedenza; montare le sezioni su un vetrino con un mezzo di montaggio fluorescente e coprire con un coverslip da 18 × 18 millimetri. Lasciare asciugare per sei-dodici ore a temperatura ambiente prima di sigillare i bordi con smalto trasparente, quindi conservare al buio o coperto a quattro gradi Celsius.

Qui sono mostrate immagini esemplificative di sezioni cerebrali marcate. Due caratteristiche importanti da ricercare sono un pattern di marcatura scarso a bassa ingrandimento e la capacità di identificare singoli componenti cellulari. Una preparazione errata dei proiettili o una fissazione eccessiva del tessuto possono portare a una marcatura scadente, come mostrato qui.

Sono forniti suggerimenti per la risoluzione dei problemi nel testo. È presente un'immagine confocale di un neurone spinoso medio del TAL proveniente dal cervello di topo e del suo complesso modello di ramificazione dendritica. La sezione ottica ottenuta mediante microscopia confocale consente l'isolamento di singole cellule marcate nella sezione di tessuto.

Le immagini ad alto ingrandimento mostrano segmenti di dendriti provenienti dal cervello di un roditore e da quello di una scimmia non umana. Si noti l'elevata intensità della colorazione fluorescente ottenuta con questa tecnica, che consente di visualizzare chiaramente le spine dendritiche quando si combina la ICS con la colorazione immunoistochimica. Questa immagine mostra un esempio di colocalizzazione dell'etichettatura D eye in rosso con la colorazione immunoistochimica per l'espressione di GFP in verde.

Questa immagine corrisponde a una sezione di sal del cervello di un topo transgenico che esprime la proteina fluorescente GFP sotto il promotore del recettore della dopamina D1. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i proiettili e utilizzare la pistola Jing per marcare in modo sparso i neuroni con coloranti fluorescenti. Questa tecnica permette una chiara visualizzazione della morfologia neuronale e lo studio della ramificazione dendritica e delle spine.