Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

Mi chiamo Gail Siebel e sono una borsista post-dottorato nel laboratorio della dottoressa Veronica Alvarez presso l'Istituto Nazionale sull'Abuso di Alcol e l'Alcolismo. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con la dottoressa Kathleen Grant e Andrew Wow dell'Oregon Primate Center e il dottor James Dene della Wake Forest University, che ha fornito il tessuto di primati non umano utilizzato in questo studio. L'obiettivo della revisione di questa procedura è quello di introdurre coloranti fluorescenti nei neuroni e marcare sezioni cerebrali di diverse specie come roditori e primati di qualsiasi età.

Allo scopo di studiare la morfologia dei dendriti e delle spine dendritiche, ciò si ottiene rivestendo prima T e perline con un colorante lipofilo come l'occhio D. Il secondo passo della procedura consiste nel rivestire il tubo con perline rivestite di D eye e tagliarlo in piccoli pezzi che fungono da proiettili per il sistema di pistole genetiche Helios. Il terzo passo della procedura consiste nel sparare perline rivestite di D eye in fette di cervello usando la pistola genetica.

La fase finale della procedura è facoltativa in quanto lo stile può essere combinato con l'immunocolorazione per localizzare contemporaneamente altri marcatori. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano una scarsa marcatura fluorescente dei neuroni adatta per l'imaging ad alta risoluzione, come la microscopia confocale o a due fotoni, e lo studio della ramificazione dendritica e della morfologia della spina dendritica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti è che la stilistica può essere applicata a sezioni cerebrali di animali di tutte le specie, età e genotipi.

Può essere utilizzato in combinazione con l'immunocolorazione e produce una marcatura fluorescente rada, adatta per la microscopia ad alta risoluzione prima di produrre proiettili. Rivestire le perle di tungsteno con colorante lipofilo in una cappa chimica a 450 millilitri di cloruro di metilene a 13,5 milligrammi di colorante lipofilo per una concentrazione finale di 30 milligrammi per millilitro. Prendi un tubo pre Eloqua contenente 300 milligrammi di perle di tungsteno e aggiungi 300 microlitri di cloruro di metilene, convoglialo energicamente per risospendere le perle e ottenere una soluzione omogenea.

Vengono utilizzati solo 100 milligrammi di perle di tungsteno per set di proiettili, pipettando su e giù per mantenere le perle risospese, aggiungere 100 millilitri di perle e l'occhio di stampo disciolto su un vetrino e mescolarli accuratamente. Con la punta di una pipetta, lasciare asciugare completamente all'aria fino a quando le perle diventano grigio chiaro. Metti un pezzo di carta bianca cerata pulita sotto il vetrino usando una lama da corsa pulita Per ogni colore di proiettili, raschiare le perline dal vetro, farle scorrere e tagliarle a dadini in una polvere fine.

Raschiare le perline rivestite su carta da siero di latte e incanalarle in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di acqua e sonicare a bagnomaria per 10-30 minuti a temperatura ambiente per eliminare completamente eventuali grumi. Tagliare 0,7 metri di tubo verde acqua con un angolo su un'estremità e collegare l'altra estremità a una siringa da 12 millilitri utilizzando un adattatore per tubi, posizionare l'estremità libera in un tubo contenente 10 millilitri di una soluzione di polivinilperone o PVP da 10 milligrammi per millilitro e aspirare completamente la soluzione attraverso il tubo e nella siringa.

Agitare la soluzione di perle mentre si pompa con la siringa per ottenere una miscela omogenea lavorando rapidamente per evitare la precipitazione delle perline, aspirare completamente la soluzione nel tubo. Evitare di introdurre bolle d'aria, che impediranno alle perline di attaccarsi al tubo in quel punto tenendo il tubo teso da entrambe le estremità. Inclinalo da un lato all'altro in modo uniforme.

Distribuire le perline. Inserire il tubo nella stazione di preparazione e lasciare che le perle si depositino per 30-60 secondi. Utilizzare la siringa lentamente ma senza intoppi.

Togliete l'acqua lasciando le perline. Scollegare immediatamente la siringa e iniziare a far girare il tubo. Regolare il flusso di azoto sulla stazione di preparazione a quattro o cinque LPM a secco per 10-20 minuti fino a quando le goccioline d'acqua non sono più visibili.

Rimuovere il tubo dalla stazione di preparazione, tagliare i proiettili in lunghezze di 13 millimetri con il tagliatubi osservato e su buoni proiettili avrà una debole foschia grigia che ricopre uniformemente l'interno. Mettere i proiettili in fiale di scintillazione avvolte in un foglio di alluminio contenenti un agente essiccante come il solfato di calcio anidro. Conservalo a temperatura ambiente fino al momento di scattare.

La marcatura Diic può essere utilizzata per colorare i neuroni nel tessuto cerebrale di diverse specie ed età e conservata con vari metodi. Posizionare le fette di cervello che sono state fissate prima o dopo l'affettatura nei pozzetti di un 24. Pozzetto piastra.

Lavare le fette in un XPB S3 volte per cinque-10 minuti per lavaggio. Pipettare il PBS con un pennello per centrare la fetta nel pozzetto. Posizionare un pezzo di filtro da 3,0 micrometri tra i due schermi di diffusione metallici all'estremità del rivestimento della canna della pistola genetica.

Tenere la pistola genetica in modo che l'estremità del rivestimento della canna sia a 1,5 centimetri di distanza dal campione. Spara le perline nella fetta con una pressione di gas elio da 120 a 180 PSI. Sciacquare rapidamente le fette tre volte con un XPBS per rimuovere il colorante in eccesso.

Assicurarsi di mantenere la superficie di iniezione della fetta rivolta verso l'alto durante tutte le fasi di manipolazione del liquido. Conservare le fette in PBS per tre-sei ore per consentire al DAI di diffondersi lungo i dendriti, coprire con un foglio. Poiché il dai è sensibile alla luce, le fette possono essere montate in questa fase o sottoposte a un'ulteriore colorazione con anticorpi come descritto nella sezione successiva per procedere con la colorazione a 300-500 microlitri di soluzione di permeazione contenente lo 0,01% di TRITTON X 100 in un XPBS per ogni fetta, incubare a temperatura ambiente per esattamente 15 minuti.

Rimuovere la soluzione permeante dai pozzetti, bloccare le fette in soluzione contenente il 10% di siero di capra e lo 0,01% di tritan X 100 in un XPBS, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere da 300 a 500 microlitri di anticorpo primario diluito in soluzione bloccante a ciascuno. Incubare bene a temperatura ambiente per una o due ore o durante la notte, a seconda dell'anticorpo, lavare le fette tre volte con un XPBS per cinque-15 minuti ogni lavaggio, rimuovere la soluzione dal pozzetto.

Aggiungere da 300 a 500 microlitri di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante a ciascuno. Lavare bene quattro volte con un XPBS per cinque o 15 minuti ogni lavaggio come prima, montare le fette su un vetrino con mezzo di montaggio fluorescente e coprire con un 18 x 18 millimetri. Lasciare asciugare da sei a 12 ore a temperatura ambiente prima di sigillare i bordi con smalto trasparente conservato al buio o coperto a quattro gradi Celsius.

Qui sono mostrate immagini esemplari di sezioni cerebrali etichettate. Due caratteristiche importanti da cercare sono un modello di etichettatura scarso a basso ingrandimento e la capacità di identificare i singoli componenti cellulari. Una preparazione errata dei proiettili o un'eccessiva fissazione del tessuto possono portare a una cattiva etichettatura, come mostrato qui.

I suggerimenti per la risoluzione dei problemi sono forniti nel testo qui. C'è un'immagine confocale di un neurone di rotazione medio TAL dal cervello di topo e il suo complesso modello di ramificazione dendritica. Il sezionamento ottico ottenuto utilizzando la microscopia confocale consente l'isolamento di singole cellule marcate nella sezione di tessuto.

Le immagini ad alto ingrandimento mostrano segmenti di dendriti provenienti da un cervello di roditore e da un cervello di primate non umano. Si noti che l'elevata intensità della colorazione fluorescente ottenuta con questa tecnica si traduce in spine dendritiche ben definite quando si combina l'ICS con l'immunocolorazione. Questa immagine mostra un esempio di colocalizzazione della marcatura dell'occhio D in rosso con la colorazione immuno per l'espressione della GFP in verde.

Questa immagine corrisponde a una fetta di sal di un topo transgenico che esprime la proteina fluorescente GFP sotto il promotore del recettore della dopamina D one. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i proiettili e usare la pistola Jing per neuroni scarsamente resistenti con coloranti fluorescenti. Questa tecnica consente la chiara visualizzazione della morfologia neuronale e lo studio delle ramificazioni e delle spine.