Editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco: una tecnica per modificare il genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane mediante meccanismo di riparazione dipendente dall'omologia a doppio filamento

La nucleasi a dita di zinco o ZFN contiene un macrodominio stabilizzato con ioni di zinco, che lega il DNA, collegato a un dominio endonucleasico tramite un linker. Questa struttura aiuta a mantenere la specificità durante il taglio del DNA.

Per utilizzare le ZFN per l'editing del genoma, è necessario prendere una coltura di cellule staminali pluripotenti umane. Integralo con un plasmide che codifica ZFN. Aggiungere un plasmide di riparazione contenente il gene bersaglio e il gene di resistenza agli antibiotici inserito tra bracci di omologia o HA. Elettroporare la miscela cellula-DNA dove la corrente elettrica facilita l'ingresso dei plasmidi all'interno della cellula.

Una volta all'interno, i motivi a dita di zinco di ZFN tradotto si legano alle triplette di coppie di basi complementari nel genoma ospite, posizionando correttamente l'endonucleasi di restrizione Fok-1 nel sito bersaglio. Gli ZFN si legano a filamenti opposti in coppie, consentendo all'omodimerizzazione di Fok-1 di formare un centro catalitico attivo in cui Fok-1 genera rotture a doppio filamento di DNA o DSB, producendo un eccesso di quattro nucleotidi.

La presenza di HA nel plasmide di riparazione guida la riparazione omologico-dipendente in cui l'estremità sporgente si inverte e utilizza la sequenza HA omologa come modello. La sintesi del DNA continua con l'aggiunta di nucleotidi complementari al gene bersaglio.

Le lacune risultanti vengono legate, facilitando l'inserimento genico. Inoltre, il gene della resistenza agli antibiotici senza promotore è espresso da un promotore ospite a monte del sito di inserimento. Le cellule modificate con successo crescono nel terreno di selezione antibiotico.