Integrazione transgenica sito-diretta mediata da phiC31-integrasi: una tecnica di microiniezione per l'integrazione di transgeni sito-specifici in un vettore di anofele

L'integrasi phiC31 è un enzima ricombinasi derivato dai fagi che catalizza la ricombinazione sito-specifica di un transgene, un gene estraneo, in un genoma ospite. Per l'integrazione del transgene in un ospite di Anopheles, iniziare con un embrione di Anopheles in un tampone adatto.

Il genoma di Anopheles è pre-ingegnerizzato con un sito di attacco per l'integrazione genica e un marcatore ciano-fluorescente per la selezione visiva. Successivamente, aggiungere a una fiala un piccolo volume di plasmide donatore che trasporta il carico transgenico desiderato, un sito di attacco, un marcatore fluorescente rosso e i componenti della spina dorsale del plasmide. Quindi, aggiungere un volume ottimale di un plasmide helper che trasporta un'integrasi codificante un gene. Ora, caricare la miscela plasmidica in una microsiringa.

Iniettare delicatamente i plasmidi nel polo posteriore dell'embrione, il sito di origine delle cellule germinali, provocando un leggero movimento del citoplasma. Una volta all'interno dell'embrione, il plasmide helper inizia a sintetizzare gli enzimi integrasi.

L'enzima integrasi media la ricombinazione sito-specifica tra il plasmide donatore e il genoma ospite. Pertanto, il transgene e il marcatore fluorescente rosso del plasmide donatore si integrano all'interno dei siti di attacco ricombinanti nel genoma di Anopheles. Successivamente, incubare l'embrione iniettato in condizioni fisiologiche per la schiusa, con vortice intermittente.

In pochi giorni, l'embrione si schiude in una larva. Al microscopio a fluorescenza, la larva di Anopheles con geni integrati con successo esprime sia la fluorescenza ciano, che marca il genoma ospite, sia la fluorescenza rossa, che marcano il transgene dal plasmide donatore.