Trasformazione genica basata su vettori cromosomici artificiali batterici binari nelle piante di Arabidopsis: una tecnica per generare piante transgeniche con inserimento a copia singola

Inizia con le piante di Arabidopsis che portano capolini immaturi. Immergere i capolini in una sospensione cellulare di Agrobacterium che trasporta T-DNA clonato con cromosoma artificiale batterico binario o BIBAC, un vettore che si replica in entrambi i sistemi E. coli e Agrobacterium. Questo vettore binario T-DNA può fornire grandi transgeni come il gene di resistenza agli erbicidi e marcatori selezionabili fluorescenti lungo un promotore specifico del seme.

Mentre i capolini sono ancora immersi, agita delicatamente le piante per migliorare il loro contatto con l'Agrobacterium. Con la sua capacità intrinseca di infettare le piante, l'Agrobacterium trasferisce il transgene nella cellula floreale. Quando il transgene entra nella cellula, si sposta verso il nucleo e si fonde con il genoma della pianta.

Ora, avvolgi la pianta nella pellicola trasparente e incubala al buio per trattenere l'umidità e migliorare la trasformazione. Rimuovere la pellicola e far crescere le piante in condizioni fisiologiche fino a quando non producono semi.

Successivamente, raccogli i semi e osserva al microscopio a fluorescenza per selezionare i trasformanti. Ora, coltiva i semi trasformati in condizioni adeguate fino alla germinazione. Spruzzare le piante con erbicida e incubare.

Le piante con inserzione multipla di transgeni subiscono il silenziamento genico e appassiscono, mentre le piante con un'inserzione a copia singola esprimono un enzima attivo che metabolizza l'erbicida e sopravvivono al trattamento. Estrarre il DNA genomico dai trasformanti sopravvissuti ed eseguire la PCR per calcolare l'efficienza dell'inserimento di una singola copia.