Transgenesi del pesce zebra mediata da trasposone Tol2: una procedura per generare pesce zebra transgenico dopo la coiniezione del sistema Tol2 in embrioni fecondati di pesce zebra

Inizia con embrioni vitali di pesce zebra in uno stadio cellulare posti nei pozzetti di uno stampo per microiniezione.

Caricare un ago per microiniezione con una soluzione contenente l'mRNA codificante la trasposasi Tol2 e plasmidi donatori trasposoni. I plasmidi comprendono un promotore ubiquitario del pesce zebra e un gene codificante una proteina fluorescente affiancato da bracci di trasposone Tol2.

Iniettare con cautela la soluzione di microiniezione nel citoplasma dell'embrione di zebrafish. All'interno della cellula, gli mRNA della trasposizione di Tol2 si traducono in proteine della trasposasi di Tol2 e vengono trasportati attivamente nel nucleo.

I siti Tol2 sul plasmide donatore comprendono specifiche ripetizioni terminali invertite, o ITR, che fiancheggiano il gene reporter. Gli ITR sono affiancati da brevi ripetizioni dirette. Le proteine della trasposasi riconoscono e si legano ai siti ITR, formando una forcina sul DNA fiancheggiante. Le trasposioni scindono ulteriormente il costrutto del trasposone dal DNA fiancheggiante, liberandolo dal plasmide e lasciando dietro di sé brevi ripetizioni dirette.

Le trasposisi creano una rottura sfalsata a doppio filamento nel genoma della cellula somatica e inseriscono il costrutto del trasposone nel sito del genoma. Il riempimento delle estremità sfalsate mediante DNA polimerasi seguito dalla legatura delle tacche crea brevi ripetizioni dirette.

La legatura provoca un'integrazione stabile del costrutto del trasposone nel genoma della cellula somatica e il promotore facilita l'espressione della proteina fluorescente. Incubare gli embrioni iniettati. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule somatiche danno origine a diversi tipi di cellule e creano pesce zebra transgenico.