Knockout genico multiplo mediato da concatemero CRISPR: una tecnica per eliminare simultaneamente più geni mediante un percorso di giunzione terminale non omologo nelle cellule intestinali di topo

Per eliminare simultaneamente più geni utilizzando il sistema CRISPR-concatemer-Cas9, iniziare con un tubo contenente la sospensione cellulare intestinale di topo. Integrare la provetta con vettori concamero CRISPR contenenti la cassetta di espressione per RNA guida multipli, o gRNA, integrati adiacenti l'uno all'altro.

Ogni cassetta di gRNA è progettata su misura per eliminare individualmente il gene desiderato. Aggiungere vettori di espressione che codificano per l'endonucleasi Cas9 alla stessa provetta. Elettroporare la miscela cellula-plasmide - una tecnica che utilizza la corrente elettrica per facilitare l'ingresso dei plasmidi nella cellula. All'interno della cellula, la co-espressione del concatemero CRISPR e del vettore Cas9 forma sequenze di gRNA e nucleasi Cas9, rispettivamente.

Ogni sequenza di gRNA si lega al corrispondente enzima Cas9, formando più complessi Cas9-gRNA che si attaccano ai siti bersaglio nel genoma ospite. Questo legame attiva l'enzima Cas9, che produce un intaccamento in entrambi i filamenti di DNA a monte del motivo adiacente al protospaziatore, o sito PAM. Ciò si traduce in una rottura a doppio filamento, o DSB, nel DNA bersaglio.

In assenza di qualsiasi sequenza omologa al gene bersaglio, viene attivato il meccanismo di riparazione endogena della cellula, chiamato unione dell'estremità non omologa, che consente alle proteine di riparazione e alle molecole chinasi di legarsi al sito di rottura. Successivamente, l'enzima ligasi ripara il DSB, con conseguenti modifiche della sequenza genica bersaglio. Queste modifiche interrompono la funzione dei geni, provocando il knockout di più geni.