PCR digitale basata su chip-in-a-tube per la quantificazione di varianti a singolo nucleotide

reazione a catena della polimerasi digitale, o dPCR, è utile per quantificare le varianti a singolo nucleotide, o SNV, una mutazione in cui la sostituzione di un singolo nucleotide in una posizione specifica nel genoma crea due variazioni nucleotidiche o alleli.

Per iniziare la quantificazione utilizzando la tecnica dPCR chip-in-a-tube, prelevare un campione di DNA contenente SNV, l'allele mutante e il corrispondente allele wild-type. Aggiungere una miscela contenente un enzima DNA polimerasi termostabile, dNTP e primer.

Successivamente, aggiungi sonde oligonucleotidiche specifiche per l'allele, etichettate con reporter di fluorescenza di colore diverso per distinguere tra gli alleli, e una molecola di quencher. La vicinanza del quencher al reporter ne sopprime la fluorescenza.

Dividere la soluzione nelle camere di reazione di un chip microfluidico. Ogni camera contenente un allele funge da recipiente di reazione indipendente.

Posizionare il tubo con il chip all'interno di un termociclatore e avviare la reazione. Ad alta temperatura, il DNA a doppio filamento si denatura in singoli filamenti. Abbassare la temperatura per ricuocere i primer e le sonde oligonucleotidiche nelle loro regioni complementari.

A una temperatura di estensione appropriata, la DNA polimerasi estende i primer e fende la sonda. La distanza dal quencher consente l'emissione di fluorescenza del reporter.

Leggi i segnali di fluorescenza di diversi colori e crea un grafico di posizione per rilevare le camere contenenti gli alleli.

Per determinare la frequenza dell'allele mutante - la frazione allelica variante - calcola il rapporto tra le camere contenenti l'allele mutante rispetto all'allele wild-type.