Saggio Dot Blot per quantificare il genoma virale

Per quantificare il DNA virale utilizzando il test del dot blot, iniziare con una sospensione di DNA virale isolata. Trattare con una soluzione alcalina per denaturare il DNA a doppio filamento in filamenti singoli per la successiva ibridazione.

Assemblare l'apparecchio per il dot blot con una membrana di nylon pre-bagnata. Caricare nei pozzetti DNA virale denaturato e soluzioni di DNA plasmidico standard linearizzato. Applicare un vuoto adatto, facilitando l'efficace trasferimento di DNA virale a filamento singolo con carica negativa e legandosi alla superficie della membrana caricata positivamente attraverso interazioni elettrostatiche, formando modelli di punti.

Dopo la seduta, lavare la membrana con tampone citrato di sodio, contribuendo a migliorare la sensibilità del saggio. Dopo l'essiccazione, esporre la membrana alla luce ultravioletta, reticolando il DNA macchiato alla membrana.

Aggiungere alla membrana un frammento di DNA denaturato termicamente e non eterologo e una sospensione di sonda di DNA marcata con fosforo radioattivo specifico per il genoma virale in tampone di ibridazione. Incubare, facilitando l'ibridazione.

I frammenti di DNA agiscono come agenti bloccanti, legandosi alle restanti regioni della membrana, riducendo al minimo il legame non specifico della sonda. La sonda radioattiva si ibrida con la sequenza complementare sul DNA virale a singolo filamento.

Lavare con tampone di lavaggio per rimuovere le sonde non ibridate. Utilizzando il sistema di scansione delle immagini al fosforo, quantificare i segnali radioattivi emessi dalle sonde radioattive ibridate al genoma virale sulla membrana, per ottenere segnali di dot blot.

Dalla curva standard, l'intensità del segnale di ciascun punto sulla membrana può essere utilizzata per calcolare la quantità di DNA virale nel campione.