Western blotting quantitativo per stimare i livelli di espressione proteica

Il western blotting quantitativo, una tecnica basata sulla normalizzazione totale delle proteine, è utile per quantificare i livelli di espressione della proteina bersaglio.

Per iniziare, caricare il lisato tissutale nei pozzetti di un gel a gradiente di poliacrilammide. Il lisato contiene la proteina bersaglio, insieme ad altre proteine cellulari.

Far funzionare il gel a una tensione appropriata per la separazione elettroforetica delle proteine del campione lungo il gradiente. Al termine, posizionare il gel sopra la membrana polimerica di una pila di trasferimento.

Applicare una corrente elettrica per trasferire le proteine separate sulla membrana. Quindi, posizionare la membrana in una colorazione fluorescente di proteine totali. Le molecole di colorante cariche nella macchia si legano elettrostaticamente a tutte le proteine sulla membrana.

Aggiungere una soluzione di blocco. Le proteine nella soluzione si legano alla membrana, quindi. impedendo il legame non specifico dei reagenti di rilevamento. Aggiungere un anticorpo primario che si lega solo alla proteina bersaglio. Quindi, aggiungi un anticorpo secondario, marcato con un fluoroforo, che si attacca all'anticorpo primario.

Eccitare il campione con un laser. Registrare la fluorescenza emessa dalle molecole di colorante della colorazione proteica totale e dai fluorofori legati agli anticorpi alle lunghezze d'onda corrispondenti.

Per calcolare il valore di carico proteico normalizzato, dividere il segnale proteico totale di ciascuna corsia per il valore più alto. Dividi il segnale della proteina bersaglio per il corrispondente valore di carico normalizzato per determinare l'espressione relativa della proteina bersaglio.