Western blotting a singola cellula per determinare l'eterogeneità cellulare

I siti di infiammazione contengono varie cellule immunitarie, tra cui monociti, macrofagi e leucociti.

Per identificare una popolazione cellulare eterogenea mediante western blotting a singola cellula, prendere un chip di blotting preidratato, costituito da un gel di poliacrilammide fotoattivabile modellato in blocchi. Ogni blocco ha numerosi micropozzetti. La creazione di modelli in più blocchi acquisisce più celle in parallelo.

Aggiungere una sospensione contenente una popolazione cellulare eterogenea. Le dimensioni del pozzo consentono l'insediamento di singole cellule. Immergere il chip in una camera di elettroforesi riempita con un tampone appropriato. Le molecole detergenti nel tampone distruggono la membrana cellulare, rilasciando il contenuto cellulare.

Applicare un campo elettrico. Le proteine rilasciate migrano attraverso il gel, separandosi in bande di dimensioni distinte. Lavare il chip con un tampone di lavaggio per rimuovere le molecole legate in modo non specifico, lasciando solo le proteine cellulari, comprese le proteine marcatrici desiderate.

Esporre il gel alla luce UV, attivando la sua superficie e immobilizzando le proteine.

Aggiungere un cocktail di anticorpi primari che si legano in modo specifico alle proteine marcatrici distintive di ciascun tipo di cellula, formando complessi anticorpali primari proteina. Erogare una miscela di anticorpi secondari marcati con fluorescenza, che legano i rispettivi anticorpi primari, marcando la corrispondente proteina marcatrice specifica della cellula.

Posiziona il chip in uno scanner. Misurare l'intensità della fluorescenza, che è proporzionale al livello di espressione del corrispondente marcatore proteico specifico per una singola cellula della sospensione cellulare campione.