Saggio di Western Blot chemiluminescente per la lavorazione delle proteine

Per eseguire il western blot, aggiungere 20 microlitri di tampone di caricamento 4X alle perle e riscaldare a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Contemporaneamente, riscaldare i controlli del lisato a 95 gradi Celsius per 5 minuti. Caricare i lisati, gli immunoprecipitanti e uno standard proteico su un gel SDS al 12,5% e far funzionare con una tensione costante di 80 volt.

Al termine della corsa del gel, trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana tamponata in una scatola e incubarla per un'ora in soluzione bloccante, agitandola delicatamente. Quindi, lavare la membrana tre volte per 5 minuti con PBST.

Per rilevare le proteine, aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata alla membrana e incubarlo per una notte a 4 gradi Celsius con una leggera agitazione. Il giorno successivo, lavare la membrana con tre lavaggi PBST di 5 minuti, quindi incubare la membrana con 20 millilitri di anticorpo secondario agitando delicatamente per 1 ora a temperatura ambiente.

Lavare nuovamente la membrana tre volte con PBST. Dopo aver eliminato l'ultimo lavaggio PBST, aggiungere circa 1 millilitro di substrato di perossido di rafano alla membrana e rilevare il segnale chemioluminescente.