Isolamento di cellule staminali da xenotrapianti di cancro pancreatico umano

Le cellule staminali tumorali o CSC hanno la capacità di auto-rinnovarsi a lungo termine e la capacità di produrre progenie differenziata. Le CSC sono state identificate in un numero crescente di neoplasie, tra cui l'adenocarcinoma pancreatico, in cui possono essere identificate in base all'attività dell'aldeide deidrogenasi e all'espressione dell'antigene della superficie cellulare, CD 44, CD 24 e CD 1 33. Qui i tumori sono isolati da topi che ospitano il cancro al pancreas umano.

Vengono generati xenotrapianti e sospensioni di singole cellule. Le cellule vengono quindi colorate con il reagente eldor, che identifica le cellule con un'elevata attività dell'aldeide deidrogenasi e l'antigene di superficie cellulare CD 44 e CD 24. Le popolazioni di cellule staminali tumorali vengono quindi isolate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

Le cellule isolate possono essere utilizzate in vari saggi funzionali e analitici a valle. L'ipotesi delle cellule staminali è un'area emergente nella biologia del cancro. In sostanza, l'ipotesi afferma che i tumori contengono sottoinsiemi fenotipici e funzionali distinti di cellule.

Alcuni sottogruppi di cellule, cellule tumorali a termine o cellule staminali tumorali possono generare tumori all'interno di topi immunodeficienti o colonie all'interno di saggi congenici in vitro. Più recentemente, si ritiene che le cellule staminali tumorali svolgano un ruolo importante nello sviluppo di metastasi e nella resistenza terapeutica. Originariamente, le cellule staminali tumorali sono state studiate nelle leucemie mieloidi utilizzando campioni di sangue periferico o di midollo osseo.

Tuttavia, con l'emergere della biologia delle cellule staminali e dei tumori solidi, è emersa la sfida di generare sospensioni di singole cellule che possano essere selezionate per flusso e studiate per applicazioni a valle. Il mio post O amico Zan ora dimostrerà questa procedura. Dimostrerò visivamente diversi passaggi critici durante questo protocollo.

A partire dalla generazione di una singola sospensione di cellule tumorali da uno xenotrapianto di cancro al pancreas umano. Quindi colorerò le cellule per l'attività dell'aldeide deidrogenasi e diversi antigeni della superficie cellulare. Infine, ordinerò le cellule utilizzando un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza.

I topi utilizzati per questo protocollo ospitano xenotrapianti di cancro pancreatico umano sottocutaneo. Questi topi sono stati precedentemente generati come segue. I tumori appena raccolti da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per adenocarcinoma pancreatico presso il Johns Hopkins Hospital sono stati tritati in pezzi da due a tre millimetri e impiantati per via sottocutanea nei fianchi di topi atimici di sei settimane.

Quando i tumori erano di circa 1,5 centimetri cubi, sono stati asportati e trapiantati in topi riceventi secondari per espandere il pool tumorale. Questo protocollo inizia con il prelievo di un tumore sottocutaneo dal fianco di un topo anthemico mediante dissezione contundente. Una volta rimosso il tumore, posizionarlo immediatamente nel tampone di dissociazione cellulare.

Quindi, pesare il tumore, quindi rimetterlo in 10 millilitri di tampone di dissociazione cellulare per un grammo di tessuto tumorale che lavora in una cappa di biosicurezza sterile. Trasferire il tumore in una piastra di coltura di 100 x 20 millimetri contenente un millilitro di tampone di dissociazione cellulare utilizzando lame di rasoio sterili e pinze. Tritare meccanicamente il tumore.

Trasferire la sospensione di cellule tumorali in una provetta conica da 50 millilitri contenente il volume rimanente del tampone di dissociazione cellulare. Successivamente, tri trate la sospensione delle cellule tumorali attraverso una pipetta sierologica da cinque millilitri per 10 volte. I pezzi di tumore devono essere piccoli in modo da non ostruire la pipetta sierologica da cinque millilitri e quindi agitare la sospensione alla massima velocità per un minuto.

Quindi incubare la sospensione di cellule tumorali a 37 gradi Celsius per due ore, vorticando per un minuto ogni 20 minuti. Dopo le due ore di incubazione, agitare la sospensione cellulare alla massima velocità per un minuto. Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 micron e raccoglierla in un tubo conico fresco da 50 millilitri.

Regolare il volume finale a 15 millilitri con DMEM contenente il 10% di FBS e striscia di penna per separare ulteriormente le cellule vitali dalle cellule morte e dai detriti tissutali. Pipettare 15 millilitri di impacco fial più lentamente sotto la sospensione cellulare per preparare un gradiente fial per la separazione mediante centrifugazione per densità. Fare attenzione a non miscelare la centrifuga a due strati a 500 G per 30 minuti a temperatura ambiente con la pausa spenta dopo la centrifugazione, le celle vitali saranno all'interfaccia del fial pack plus e del tampone di dissociazione cellulare.

Trasferirli in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere DMEM fresco integrato con il 10% di FBS alla sospensione cellulare per diluirla da una a tre centrifughe, centrifugare le cellule isolate a 450 G per 10 minuti a temperatura ambiente dopo la centrifugazione del resus, sospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone alor, che viene fornito nel kit di colorazione alor e verrà utilizzato nelle successive fasi di colorazione cellulare. Successivamente, diluire 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 millilitri di blu trian e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro.

Se durante questo passaggio si nota un gran numero di cellule morte o detriti di tessuto, ripetere la cella. La separazione mediante celle di centrifugazione per densità sarà colorata per l'attività dell'aldeide deidrogenasi. Utilizzando l'alde Fluor, le cellule reagenti saranno anche colorate per diversi antigeni di superficie cellulare utilizzando specifici anticorpi coniugati fluoro quattro.

Etichettare sette provette in polistirene da 12 x 75 millimetri e posizionarle sul ghiaccio. Diluire la sospensione cellulare in due millilitri di tampone eldor a una concentrazione finale da cinque a 10 milioni di cellule per millilitro e mantenerla in ghiaccio. Quindi, secondo le istruzioni contenute nel protocollo scritto allegato, preparare i seguenti esempi per impostare i controlli di compensazione sull'area fax.

Citometro a flusso, prime cellule di controllo non colorate con ST. Seconda cella colorata con CD 44 A PC. Terza cellula colorata con CD 24 PE e quarta cellula colorata con topo CD 31 biotina di topo lignaggio, biotina topo, H due KD, biotina e streptavidina per cp. Preparare anche un quinto campione contenente solo ALOR e un sesto campione per impostare i cancelli A LDH positivo e CD 44 positivo CD 24 positivo.

Questo campione conterrà ELDOR DEAB, un inibitore degli anticorpi di controllo isotopico dell'aldeide deidrogenasi. IgG due B kappa a PC IgG due a kappa PE topo CD 31 biotina lignaggio di topo, biotina topo, H due KD, biotina e streptavidina per cp. Quindi, nella provetta finale, colorare le cellule con alor CD 44 A PC CD 24 PE topo CD 31 biotina lignaggio di topo, biotina topo, H due KD, biotina e streptavidina per cp.

Questo è il campione effettivo da selezionare una volta eseguita tutta la colorazione, tenere le provette sul ghiaccio al buio fino a quando non viene eseguita la selezione delle cellule. Questo protocollo di smistamento porterà all'isolamento delle CSC pancreatiche A LDH positive CD 44 e CD 24 positive. Poco prima della cernita, aggiungere due milligrammi per millilitro di ioduro di propidio al tubo di gating positivo A L DH CD 44 positivo CD 24 per eliminare le cellule non vitali utilizzando il lignaggio di topo non ST colorato CD 44 A PC CD 24 PE e le cellule alor impostano i controlli di compensazione su un flusso FIA.

Il citometro genera gate basati su parametri di dispersione diretta e laterale per raccogliere singoletti cellulari. Utilizzare i tubi non colorati con ST e di lignaggio del topo per creare un cancello per il non utilizzo per CP negativo e per le cellule vitali allo ioduro di propidio utilizzando il canale FL a tre. La maggior parte degli xenotrapianti di cancro al pancreas umano contiene dal 20 al 60% di cellule derivate dal topo utilizzando il cocktail di lignaggio del topo CD 31 e il topo H due kd.

Gli anticorpi coniugati con biotina che utilizzano le cellule trattate con DEAB generano gate nel canale FL one per le cellule A LDH positive. La frequenza della popolazione A L DH positiva da diversi xenotrapianti è variabile, ma generalmente è compresa tra l'uno e il 4% della popolazione cellulare totale. Quindi posizionare le celle per lo smistamento nella porta fax e utilizzare questi cancelli.

Raccogliere le cellule A LDH positive in provette di polistirene da 12 x 75 millimetri contenenti un millilitro di DM EM integrato con il 10% di FBS. Successivamente, generare gate creati utilizzando cellule colorate con eldor IgG due B kappa a PC e IgG due a kappa PE nei quattro canali FL e FL due canali. Quindi raccogli CD 44 positivi CD 24 positivi, che generalmente sono dallo 0,2 al 5% della popolazione totale dopo che ogni popolazione cellulare è stata ordinata.

Centrifugare la sospensione cellulare a 450 G per 10 minuti e risospendere le cellule in 500 millilitri di DMEM fresco integrato con il 10% di FBS, contare il numero di cellule selezionate utilizzando un emocitometro. Questa procedura porterà all'isolamento delle CSC pancreatiche vitali. Queste cellule possono essere utilizzate per una serie di saggi analitici e funzionali che richiedono cellule vitali.

Li abbiamo utilizzati per misurare la crescita e l'invasione clonica in vitro. Li abbiamo utilizzati per misurare l'inizio del tumore in vivo e la formazione di metastasi e li abbiamo utilizzati per eseguire analisi genetiche comparative. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa sette ore.

Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per ottenere una popolazione pura di cellule vitali. In primo luogo, gli xenotrapianti di diametro maggiore inferiore a un centimetro avranno la minor quantità di tessuto necrotico all'interno dei tumori. Ciò garantirà la minor quantità di cellule non vitali e detriti tissutali che contaminano la popolazione finale di cellule isolate.

In secondo luogo, durante la generazione di una singola sospensione di cellule tumorali, è importante lavorare rapidamente e mantenere le cellule o il tumore in terreni integrati con il 10% di siero per migliorare la vitalità cellulare. In terzo luogo, una volta iniziata la colorazione cellulare con il reagente alde Fluor e gli anticorpi, è importante mantenere le cellule sul ghiaccio e mantenerle nel tampone alor in modo da ridurre la quantità di afflusso del reagente alor dalle cellule. Inoltre, è importante mantenere le cellule al buio il più possibile in modo da ridurre la quantità di fotosbiancamento dei quattro fluoro.

Infine, è importante contare manualmente le cellule utilizzando un emocitometro. Poiché il citometro a flusso fornisce spesso conteggi cellulari imprecisi.